Evaluación de comunidades procarióticas en las profundidades del Atlántico sudoccidental.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12782 (2023) Citar este artículo

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Las pendientes continentales pueden contribuir significativamente a la productividad marina y al ciclo del carbono. Estas regiones pueden albergar características geológicas distintas, como diapiros salinos y marcas de viruela, en las que sus depresiones pueden servir como trampas naturales de sedimentos donde se pueden acumular diferentes compuestos. Investigamos las comunidades procarióticas en sedimentos superficiales (0–2 cm) y subterráneos (18–20 o 22–24 cm) de un campo de diapiro salado y pockmark en la cuenca de Santos, en el suroeste del Océano Atlántico. La codificación de metabarras de 16 muestras reveló que los sedimentos superficiales estaban dominados por la clase arqueal Nitrososphaeria, mientras que la clase bacteriana Dehalococcoidia era la más prevalente en las muestras del subsuelo. Se encontró que los estratos de sedimentos eran un factor significativo que explicaba el 27% de la variabilidad en la composición de la comunidad. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre las características geomorfológicas. También realizamos un análisis metagenómico de tres muestras de superficie y analizamos el genoma ensamblado en metagenoma recuperado de la más alta calidad, que pertenecía a la familia CSP1–5, filo Methylomirabilota. Este metilotrofo no metanotrófico contiene genes que codifican la oxidación del metanol y las vías del ciclo de Calvin, junto con diversas funciones que pueden contribuir a su adaptación a hábitats de aguas profundas y a condiciones ambientales oscilantes. Al integrar los enfoques metagenómicos y de codificación de barras, informamos que CSP1-5 prevalece en las muestras de sedimentos de la pendiente de la cuenca de Santos, lo que indica la importancia potencial del metabolismo del metanol en esta región. Finalmente, utilizando un enfoque filogenético que integra secuencias de ARNr 16S asignadas a Methylomirabilota en este estudio con aquellas de una base de datos pública, argumentamos que las secuencias públicas de CSP1-5 podrían clasificarse erróneamente como Methylomirabilaceae (el clado metanotrófico) y, por lo tanto, el papel de estos organismos. y el ciclo del metanol también podría descuidarse en otros entornos.

Los márgenes continentales son ambientes complejos y únicos que interconectan procesos terrestres y marinos, desempeñando un papel importante en los ciclos biogeoquímicos del carbono y el nitrógeno1. Aunque las plataformas y taludes continentales representan sólo el 20% del área oceánica, estas regiones pueden representar hasta el 50% de la productividad marina2,3. La mineralización de la materia orgánica en estas áreas ocurre a un ritmo mucho más rápido en comparación con lo que ocurre en los sedimentos de mar abierto, permitiendo que los nutrientes regenerados regresen rápidamente a sus ciclos naturales4,5. Las pendientes continentales a menudo comprenden una amplia gama de características físicas y geológicas que pueden afectar la distribución de nutrientes y, en consecuencia, la biodiversidad6. Esta variabilidad es particularmente importante para las comunidades microbianas bentónicas, que se sabe que responden a cambios en la disponibilidad de nutrientes y el tipo de sustrato de carbono7. Dado que los procesos microbianos son esenciales para la biogeoquímica de los océanos y la mineralización de la materia orgánica5, es crucial comprender sus funciones en los ciclos del carbono locales y regionales.

La Cuenca de Santos (SB) es una cuenca marginal ubicada en el margen Atlántico suroeste. En esta región, el talud continental superior a medio presenta un alto declive y está marcado por numerosas características del fondo marino de escala kilométrica, incluidas marcas de viruela y diapiros de sal exhumados8,9. Las marcas de viruela son depresiones similares a cráteres formadas por la liberación repentina de líquido (predominantemente metano) en forma de gas o líquido a la superficie10,11. En la Cuenca de Santos, la expulsión de fluidos se ve facilitada por el movimiento de grandes volúmenes de sal, debilitando las capas sedimentarias superiores9. Debido a las fuerzas gravitacionales, estas masas de sal presentan un movimiento vertical (diapiro), que puede o no quedar expuesto en la superficie sedimentaria marina8,12. Se ha informado que el campo pockmark en el talud continental de SB contiene más de novecientas depresiones relacionadas con esta característica geológica y diapiros salinos. Aunque se cree que la mayoría de las marcas de viruela en esta área no filtran activamente gas, los datos acústicos y los indicadores metálicos han sugerido la presencia de actividades de filtración recientes o subrecientes en algunas de las marcas de viruela9,13,14,15,16. Además, las características únicas del fondo marino en esta área pueden proporcionar una gran variedad de hábitats para comunidades microbianas diversas pero aún poco exploradas17.

Las vertientes continentales suelen presentar una alta acumulación de sedimentos y deposición de materia orgánica9,18. Además, las depresiones a modo de marcas de viruela pueden servir como trampas naturales de sedimentos16, donde puede producirse la sedimentación de diferentes compuestos, entre ellos el metanol, un carbono reducido muy abundante en el medio marino19,20. Este hidrocarburo C1 tiene una rápida renovación en este ambiente, del orden de unos pocos días, lo que indica su importancia en los ciclos biológicos, principalmente como fuente de carbono y energía para microorganismos metilotróficos21,22.

Las capacidades metabólicas versátiles brindan a las comunidades microbianas del fondo marino diferentes estrategias para adaptarse a condiciones oligotróficas y variables. La importancia del metabolismo del C1 en los sedimentos de aguas profundas ha sido sugerida recientemente por Torres-Beltrán et al. 23, incluida la oxidación de metanol a formaldehído. Los autores también detectaron funciones relacionadas con la oxidación de formaldehído en el talud continental del sur del Golfo de México. Sin embargo, la identidad, las capacidades metabólicas y la distribución de estos organismos exigen una mayor exploración. Si bien algunos grupos metilotróficos se han estudiado ampliamente, otros han surgido recientemente de genomas ensamblados en metagenomas (MAG). Abrazo y col. 24 describieron un genoma de un metilotrofo no metanotrófico del filo Methylomirabolota (anteriormente NC10), un grupo conocido principalmente por sus miembros metanotróficos dependientes de nitrato, lo que ha planteado preguntas sobre los límites filogenéticos de los diferentes grupos metilotróficos en este filo.

En este estudio, utilizamos metacódigos de barras y metagenómica para investigar la diversidad procariótica en sedimentos superficiales y subterráneos recolectados en el campo pockmark y diapiro salado en el talud continental de SB. Además, a través de la reconstrucción del genoma a partir de datos metagenómicos, describimos el MAG de un metilotrofo del orden Methylomirabilales, que estaba muy extendido en los sedimentos de SB. Exploramos más a fondo sus adaptaciones al ambiente de las profundidades marinas y luego discutimos sus capacidades metabólicas potenciales y sus roles en el ciclo del carbono a lo largo del talud continental de SB.

La Cuenca de Santos (SB) está ubicada en el margen continental sur de Brasil entre las latitudes 27° S y 26° N, cubriendo un área de 3,5 × 105 km2. La SB limita al norte con el Alto de Cabo Frío y al sur con el Cabo Santa Marta Grande en el Alto de Florianópolis25. Desde el punto de vista hidrográfico, el área de estudio se localiza en la transición entre dos masas de agua, el Agua Central del Atlántico Sur (SACW) y el Agua Intermedia Antártica (AAIW) 33. El SACW (T ≤ 18,5 °C, S ≥ 35.3) ocupa el nivel de picnoclina, mientras que el AAIW presenta temperaturas entre 3 y 6 oC y salinidades entre 34.2 y 34.526,27,28.

Recogimos muestras de sedimento utilizando un sacatestigos de caja de acero inoxidable BX-650 (Ocean Instruments, San Diego, California, EE. UU.) (50 cm × 50 cm) con una penetración máxima de 60 cm. Se utilizaron sacatestigos cilíndricos para recolectar sedimentos dentro del sacatestigos de caja manteniendo al mismo tiempo la estratificación de los sedimentos. Los núcleos de sedimento se cortaron en capas de 2 cm con espátulas estériles y se colocaron en bolsas Whirl Pak, luego se almacenaron a -20 °C hasta su procesamiento. Para este estudio, se seleccionaron ocho estaciones con batimetría que oscilan entre 400 y 800 m aproximadamente, comprendiendo tres estaciones ubicadas en diapiros salinos, tres estaciones en pockmarks y dos estaciones en el fondo marino adyacente considerados como sedimentos de control, sin pockmarks ni influencia de diapiros salinos. (Figura 1). Utilizamos la capa de sedimento superficial (0–2 cm) y la más profunda (16–18 o 22–24 cm), de ahora en adelante llamados estratos superficiales y subsuperficiales, respectivamente (Tabla S1).

Mapa de la región de estudio ubicada en la Cuenca de Santos, destacando los sitios de muestreo donde se encontraron estructuras relacionadas con viruelas y pañales de sal en el margen continental brasileño.

El ADN se extrajo de 0,25 g de sedimento utilizando el kit de aislamiento de ADN Power Soil (Qiagen, Alemania), siguiendo las especificaciones del fabricante. La integridad del ADN se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (v/v) y la concentración se evaluó utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La región hipervariable V4-V5 de la secuencia de ARNr 16S se amplificó con los cebadores universales 515F y 926R29,30. La reacción de PCR inicial consistió en un paso de desnaturalización a 95 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos con 95 °C durante 30 s, hibridación a 57 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 30 s y extensión final. a 72°C durante 5 min. La preparación y secuenciación de la biblioteca fueron realizadas por Mr DNA/Molecular Research (Shallowater, TX, EE. UU.), utilizando la plataforma Illumina Miseq (sistema de 2 × 250 pb). Los datos de secuenciación de ARNr 16S están disponibles en los archivos de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica con el ID de BioProyecto PRJNA818533.

Después de la secuenciación, las lecturas de extremos emparejados se importaron inicialmente y se demultiplexaron en la versión 2019.1031 del software QIIME2. Se realizó una inspección gráfica de los perfiles de calidad, se recortaron las lecturas de baja calidad (por debajo de la puntuación de Phred 30) y se eliminaron las quimeras con la ayuda del software Dada232. Después del control de calidad, las variantes de la secuencia del amplicón (ASV) se determinaron utilizando el software Dada2 en el paquete QIIME2. La taxonomía se asignó a través del clasificador de características classify-sklearn y la base de datos SILVA v. 138. Los índices de riqueza ASV, Chao1 y diversidad de Shannon se calcularon usando los paquetes phyloseq33 y vegan34, y se usó ggplot233 para realizar gráficos en R v. 4.1.0 (R Development Equipo, 2018). La normalidad de las varianzas se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las similitudes entre muestras y grupos de sitios se examinaron utilizando la distancia normalizada Unifrac ponderada ordenada y se visualizaron mediante escalamiento multidimensional no métrico (NMDS). La diversidad alfa, el análisis estadístico y la visualización de datos se llevaron a cabo en R utilizando el paquete Phyloseq33. Las diferencias en las comunidades microbianas entre sitios y profundidades se evaluaron mediante análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA)35.

Realizamos análisis metagenómicos de tres muestras de sedimentos superficiales de las siguientes estaciones: 259 (área de diapiro), 260 (área de diapiro) y 255 (área de control). Las bibliotecas metagenómicas se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) y la secuenciación se realizó en la plataforma Illumina Hiseq (sistema de 2 × 150 pb) en el Laboratorio de Biología Marina del Instituto Woods Hole, como parte de el “Censo del proyecto Deep Life del Deep Carbon Observatory”. Las lecturas sin procesar se filtraron a través del software SICKLE con phred > 30 y luego se usaron para la reconstrucción del genoma a través del anvi'o pipeline v. 7.134. El coensamblaje se realizó utilizando el software Megahit36, y los contigs con un tamaño > 4000 pb se seleccionaron para agruparlos a través del software CONCOCT37. Los contenedores se refinaron manualmente usando anvi-refine34 y luego se verificó la calidad con CheckM v. 1.0.738. Los MAG se clasificaron taxonómicamente según la filogenia del genoma de acuerdo con el flujo de trabajo de clasificación (classify_wf) del Genome Taxonomy Database Toolkit (GTDB-Tk v. 1.3.0) y la Genome Taxonomy Database (GTDB; versión 202)39. Las secuencias sin procesar del metagenoma están disponibles en el repositorio de GenBank con el ID de BioProject PRJNA818670.

Para análisis adicionales, seleccionamos el MAG con las puntuaciones de calidad más altas, el SB_MAG_00001 (94,2% de integridad y 2,1% de contaminación), clasificado dentro del filo Mmethylomirabilota (anteriormente filo NC10). La predicción y anotación de ORF se realizaron utilizando prokka v.14.540. Se utilizaron Ghost-KOALA (genus_prokaryotes) y SEED Subsystem a través de RASTtk40 para las anotaciones funcionales de las secuencias de proteínas predichas. Se utilizaron la herramienta MetabolismHMM v. 1.9 (https://github.com/elizabethmcd/metabolisHMM) y la herramienta DRAM (Distilled and Refined Annotation of Metabolism) v. 1.2.4 (https://github.com/shafferm/DRAM) para anotar genes relacionados con los metabolismos del azufre, el nitrógeno y el carbono. La cobertura y abundancia relativa del MAG en relación con su biblioteca de secuencias de coensamblaje se estimó utilizando Bowtie2 2.3.241. El MAG se depositó en Figshare en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20080031.

Se construyó un árbol filogenético para verificar las relaciones filogenéticas entre los miembros del filo Methylomirabilota recuperados de nuestras muestras de sedimentos mediante metabarcodes y metagenómica. Primero, seleccionamos todas las secuencias asignadas a este filo que se encuentran en nuestros datos de secuenciación de ARNr 16S (23 ASV) y luego extrajimos la secuencia de ARNr 16S del MAG SB_MAG_00001 usando el software barrnap (versión 0.9, https://github.com/tseemann /barrnap). Además, se extrajeron secuencias de 16S rRNA de tres genomas de referencia del orden Mmethylomirabilaliles, disponibles en el NCBI (National Center for Biotechnology Information): Candidatus Mmethylomirabilis oxyfera (Ca. M. oxyfera) (NCBI:txid671143), Candidatus Methylomirabilis limnetica (Ca. . M. limnetica) (NCBI: txid671143), y la bacteria NC10 CSP1-5 (NCBI:txid1640516). Finalmente, utilizamos todas las secuencias de ARNr 16S disponibles en la base de datos SILVA que mostraron al menos un 95% de identidad con nuestras secuencias de ARNr 16S de Methylomirabilota y la secuencia de ARNr 16S extraída de nuestro MAG SB_MAG_00001 (34 secuencias). Las secuencias de referencia de la base de datos SILVA se recuperaron de ecosistemas marinos y terrestres.

Todas las secuencias fueron alineadas utilizando el software Mega X42 mediante el algoritmo clustalW que utiliza métodos de alineación progresiva43. Este algoritmo calcula una matriz de distancia aproximada entre pares de secuencias en función de las puntuaciones de alineación. El árbol filogenético se construyó por el método de máxima verosimilitud con replicaciones Bootstrap iguales a 999.

La secuenciación del gen 16S rRNA de las 16 muestras arrojó un total de 573.850 lecturas filtradas de calidad, divididas en 11.034 variantes de secuencia de amplicones (ASV) (corte de 0,03). De ellos, 9244 ASV fueron asignados a Bacteria y 1788 a Archaea. La riqueza y diversidad evaluadas mediante los índices Chao1 y Shannon (Tabla S2) no cambiaron significativamente entre los tipos de lecho marino muestreados (control, diapir, pockmark) y entre los dos estratos de sedimentos (estratos superficiales y subsuperficiales) (Tabla S3).

Los sedimentos superficiales estuvieron dominados por la clase arqueal Nitrososphaeria (Crenarchaeota) en todos los tipos de lecho marino, representando hasta el 25% de las asignaciones taxonómicas (Fig. 2). Nitrososphaeria es una de las clases de Archaea más ampliamente distribuida y se encuentra en una diversidad de ambientes44,45, incluyendo agua y sedimentos marinos46,47. Comprende taxones quimiolitoautotróficos oxidantes de amoníaco, que desempeñan un papel importante en los ciclos marinos del nitrógeno y el carbono48. Alfa y Gammaproteobacterias representaron entre el 11 y el 18% de las asignaciones de ASV. Estas clases también han sido reportadas como parte de los grupos dominantes en ambientes marinos bentónicos, incluidos los sedimentos de viruela45,49,50,51,52.

Gráficos de barras que muestran la abundancia relativa de clases de bacterias y arqueas en las muestras de sedimentos Control, Diapir y Pockmark recolectadas en la Cuenca de Santos. Superficie = 0–2 cm y subsuperficie = 16–18 cm o 22–24 cm.

La clase NB1-J, descrita previamente en muestras de sedimentos de marcas de viruela activas52, fue detectada en sedimentos superficiales del SB. La clase Methylomirabilia, del filo Methylomirabilota (antes NC10), se encontró en todas las muestras de superficie, con una abundancia promedio de aproximadamente el 2,6%. Los miembros de esta clase han sido identificados en los ambientes más diversos, desde agua dulce hasta salino, e incluyen taxones metilotróficos metanotróficos y no metanotróficos24,53,54.

En las muestras del subsuelo, los Dehalococcoidia representaron hasta el 24% de las comunidades. Algunos miembros de esta clase pueden realizar respiración organohaluro, respiración anaeróbica que utiliza compuestos orgánicos halogenados como aceptores terminales de electrones para la oxidación del hidrógeno55. La deshalogenación microbiana juega un papel importante en el funcionamiento del ciclo de los halógenos, y muchos de estos organismos se encuentran en el medio marino, principalmente en sedimentos subterráneos55,56. La clase Phycisphaerae (phylum Planctomycetota) también prevaleció en todas las muestras del subsuelo de SB, alcanzando hasta el 17% de las comunidades. Estos organismos son aeróbicos o anaeróbicos facultativos y colonizan una amplia variedad de ecosistemas, desde acuáticos hasta terrestres e incluso ambientes extremos como suelos desérticos, salinos y térmicos57,58,59,60.

Las desulfobacterias, una clase conocida por contener bacterias reductoras de sulfato, una función clave en el ciclo del azufre y la respiración anaeróbica61, presentaron una abundancia relativa entre el 0,2 y el 9,8% de las comunidades del subsuelo. La clase Methylomirabilia, encontrada en todas las muestras analizadas, representó aproximadamente el 1,5% de las comunidades en las muestras del subsuelo. Nitrososphaeria comprendió una proporción mucho menor en los estratos más profundos que en las muestras de superficie. Por el contrario, otra clase Crenarchaeota, Bathyarchaeia, se encontró en mayores proporciones en los sedimentos del subsuelo. Estos organismos están ampliamente distribuidos y son abundantes en los sedimentos marinos; sin embargo, los factores ambientales que controlan su distribución no están claros actualmente62. Son metabólicamente diversos e indicados por Lazar et al. 63 como degradadores de compuestos aromáticos y materia orgánica recalcitrante. La capacidad acetogénica para sintetizar litotróficamente acetato a partir de carbono inorgánico también se ha sugerido a través de estudios de MAG, así como la capacidad potencial para metabolizar metano; sin embargo, estos metabolismos aún no han sido confirmados por estudios fisiológicos ya que aún no han sido cultivados en condiciones de laboratorio53,64.

Según el análisis PERMANOVA, el tipo de fondo marino no fue un factor significativo que afectó la composición de las comunidades (Tabla S4). Por el contrario, el 27% de la variabilidad de la comunidad (p <0,001) se explicó por los estratos de sedimentos verticales: superficie (0–2 cm) versus subsuperficie (16–18 cm o 22–24 cm). Estos hallazgos concuerdan con estudios previos que muestran diferencias notables en las comunidades procarióticas a lo largo de los estratos de sedimento, lo que se atribuye a los cambios bruscos en las condiciones físicas y químicas con la profundidad17,49,65,66. Otro patrón interesante fue revelado por la ordenación NMDS, donde todas las comunidades de sedimentos superficiales se concentraron en un grupo apretado, lo que indica una alta similitud en su composición, mientras que se observó una menor similitud entre las muestras del subsuelo (Fig. 3). Como los sedimentos superficiales están en contacto directo con el ambiente pelágico, sus características bióticas y abióticas sufren influencias más fuertes de los recientes procesos de deposición e intercambios con la columna de agua. Este aspecto también contribuye a la mayor disponibilidad de carbono orgánico67,68. Además, los aceptores de electrones de alta energía, como el oxígeno y el nitrato, suelen estar disponibles en los sedimentos superficiales69. Por el contrario, las capas de sedimentos más profundas pueden reflejar eventos durante la deposición, como diferentes tasas de sedimentación70, que pueden variar a lo largo del talud continental71,72.

Escala multidimensional no métrica (NMDS) de las comunidades de sedimentos de la superficie (0 a 2 cm) y del subsuelo (16 a 18 cm o 22 a 24 cm). Estrés = 0,011177. Las formas geométricas indican estratos de sedimentos y los colores indican sitios de recolección.

El análisis del microbioma central respaldó aún más estos patrones contrastantes de la similitud de la comunidad al comparar los estratos de la superficie y el subsuelo. En este análisis, preguntamos si habría ASV comunes a todas las muestras dentro de cada estrato, así como a todas las muestras independientemente del estrato (microbioma central central). Mientras que todas las muestras de sedimentos superficiales (microbioma central de la superficie) compartían 80 ASV, que comprenden taxones arqueales y bacterianos de diez filos diferentes, el microbioma central de los estratos profundos estaba compuesto por solo dos ASV, que también eran el microbioma central central, es decir, presente en todas las muestras (Tabla S5). Estos dos ASV fueron asignados a las familias Methylomirabilaceae e Hyphomicrobiaceae, según la base de datos SILVA v.138. En dos estudios recientes realizados en sedimentos de aguas profundas de la cuenca de Santos, se informó que el filo Methylomirabolota se encontraba entre los grupos dominantes en diferentes batimetrías (de 450 a 1250 m)17 y en áreas enriquecidas con metano73. La familia Hyphomicrobiaceae (Alphaproteobacteria) ha sido identificada en varios hábitats marinos y no marinos74,75 y es morfológica y fisiológicamente diversa, y se sabe que la mayoría de sus miembros realizan un metabolismo quimioheterotrófico aeróbico. Sin embargo, algunos representantes, como los miembros del género Hyphomicrobium, pueden crecer anaeróbicamente mediante desnitrificación o fermentación75. Curiosamente, al igual que los Mmethylomirabilales, la familia Hyphomicrobiaceae también comprende representantes asimiladores de metanol24,76,77, lo que sugiere que los organismos metabolizadores de C1 podrían estar muy extendidos en el área estudiada. Sin embargo, todavía existen muchas lagunas en el conocimiento sobre la dinámica de los microorganismos metilotróficos y sus capacidades metabólicas en los sedimentos de aguas profundas.

La biblioteca metagenómica construida a partir de tres muestras de sedimentos superficiales arrojó 77.922.888 lecturas sin procesar. Después del filtrado de calidad, el número de lecturas por muestra fue 23.406.011 (Surface_255), 19.431.982 (Surface_259) y 22.090.471 (Surface_260). El coensamblaje dio como resultado 108.018 contigs (> 1000 pb, N50 = 1492 pb), que se agruparon en 34 MAGS: dos borradores de alta, seis de media y 26 de baja calidad, de acuerdo con los estándares de calidad del genoma sugeridos por Bowers. et al. 78 (Tabla S6). SB_MAG_00001 exhibió los parámetros de calidad más altos (integridad del 94,2 % y contaminación del 2,1 %) y representó el 0,4 % de las lecturas mapeadas (cobertura de 30 veces). Según el análisis filogenómico de GTDB-Tk, este MAG fue asignado al orden Methylomirabiles, familia CSP1-5 (ANI del 97,77% con CSP1-5 sp001443495 como genoma representativo más cercano).

Teniendo en cuenta los datos presentados, cabe destacar que se observaron asignaciones taxonómicas contrastantes para los miembros del orden Mmethylomirabilales recuperados mediante los diferentes enfoques de secuenciación en nuestro estudio. Al utilizar la base de datos SILVA v.138 para clasificar secuencias de ARNr 16S, todos los ASV del orden Mmethylomirabilales fueron asignados a la familia Methylomirabilaceae (incluido uno de los dos ASV del microbioma central central). Por el contrario, el genoma de SB_MAG_00001 se clasificó dentro de la familia CSP1-5, según GTDB-Tk. Aunque Mmethylomirabilales todavía es un taxón poco conocido, esta diferencia en la taxonomía puede tener implicaciones importantes para nuestras conclusiones sobre la función microbiana y el ciclo del carbono, ya que estas familias tienen distintas capacidades metabólicas clave.

Hasta la fecha no existe ningún cultivo aislado del orden Methylomirabilales. Los organismos más estudiados pertenecen a la familia Mmethylomirabilaceae (Ca. Methylomirabilis oxyfera, Ca. M. limnetica y Ca. M. lanthanidiphila), que se sabe que llevan a cabo la oxidación anaeróbica de metano (OMA) acoplada a la reducción de nitritos54,79,80 . A diferencia de otros procesos de OMA, emplean maquinaria enzimática similar a la metanotrofia aeróbica, incluida su enzima central, la metano monooxigenasa. El oxígeno necesario para este proceso se produce intracelularmente por desproporción del óxido nítrico (NO)80. Sin embargo, este complejo enzimático oxidante de metano está ausente en CSP1-5, un genoma recuperado de muestras de sedimentos de acuíferos24 y caracterizado como un metilotrofo no metanotrófico. El genoma CSP1-5 comparte el 89% de la identidad de la secuencia del ARNr 16S con Ca. M. oxifera. Las diferencias filogenéticas descritas entre CSP1-5 y Ca. M. oxyfera establece los límites de la desnitrificación junto con la oxidación de metano dentro del filo Methylomirabilota24.

Al inspeccionar la base de datos SILVA (v.138), es posible verificar que Methylomirabilaceae es la única familia registrada dentro del orden Methylomirabilales en su biblioteca. Por lo tanto, preguntamos si los microorganismos similares a CSP1-5 en nuestras muestras podrían haber sido clasificados erróneamente en la base de datos SILVA. Para responder a esta pregunta, se construyó un árbol filogenético utilizando las secuencias del amplicón de ARNr SB 16S clasificadas en el filo Methylomirabilota y los fragmentos SSU extraídos de SB_MAG_00001 y de tres genomas de referencia: Ca. M. oxifera, Ca. M. limnetica y CSP1-5. Además, también se utilizaron secuencias de ARNr 16S descargadas de SILVA (consulte los métodos para obtener más detalles). Según Ettwig et al. (2009)81, el filo Methylomirabolota se puede dividir en cuatro grupos: A, B, C y D. Los grupos A y B se consideran las ramas dominantes y albergan los microorganismos anaeróbicos oxidantes de metano. Los miembros de la familia CSP1-5 se encuentran en el grupo D. Todos los demás miembros de este filo se asignan al clado C81. En el árbol filogenético presentado en la Fig. 4, las secuencias de ARNr 16S se agruparon en tres clados principales: un clado estaba formado únicamente por secuencias extraídas de los genomas de referencia de los taxones metanotróficos, Ca. M. oxyfera y Ca. M. limnetica (ambos del grupo A)54,81. El grupo más grande albergaba 22 ASV obtenidos en este estudio mediante secuenciación de amplicones y las secuencias extraídas de los genomas de SB_MAG_00001 y CSP1-5. Por lo tanto, el patrón de agrupamiento indica que las secuencias del amplicón SB están más estrechamente relacionadas con CSP1-5 que los genomas metanotróficos. Este hallazgo sugiere que esas secuencias pueden haber sido mal clasificadas por la base de datos SILVA y, de hecho, podrían pertenecer a la misma familia que SB_MAG_00001, CSP1-5. Además, este gran grupo también contenía 34 secuencias descargadas de la base de datos SILVA (recuperadas de ecosistemas marinos y terrestres) y clasificadas dentro de la familia Mmethylomirabilaceae. Según este análisis, es posible que estudios previos hayan informado de manera inexacta la presencia de microorganismos oxidantes de metano y hayan descuidado la importancia del metabolismo del metanol en esos ambientes (Tabla S7). El tercer grupo comprendía diez secuencias de la base de datos SILVA y solo un ASV recuperado de este estudio mediante secuenciación de amplicones. Todos los miembros de este grupo pertenecen al orden Rokubacteriales. Curiosamente, a excepción del ASV obtenido en este estudio, todas las secuencias del tercer clado se recuperaron de ambientes terrestres.

Árbol filogenético comparando las secuencias 16S afiliadas al orden Methylomorabilales obtenidas en nuestras muestras, junto con la secuencia 16S recuperada de SB MAG 00001. El análisis también incluye secuencias 16S recuperadas de los genomas de referencia: Ca. Metilomirabilis oxyfera, Ca. Mmethylomirabilis limnetica y NC10 bacteria CSP1–5, obtenidos a través de datos depositados en NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Además, también se utilizaron secuencias de ARNr 16S recuperadas de la base de datos Silva 138, con al menos un 95% de similitud con las secuencias de este estudio.

SB_MAG_00001 contiene conjuntos de genes completos o casi completos para las siguientes vías centrales del metabolismo del carbono y la energía: glucólisis, gluconeogénesis, oxidación del piruvato, ciclo del TCA, vía de las pentosas fosfato y ciclo de Calvin. El MAG contiene genes para la metanol deshidrogenasa (MDH) de tipo Xox dependiente de lantánidos, que puede convertir metanol en formaldehído o directamente en formato82,83,84. También se ha propuesto que XoxF-MDH puede oxidar formaldehído a formiato83. Varios estudios han sugerido la naturaleza generalizada de Xox-MDH dentro de los metilotrofos, con su relevancia funcional en el medio ambiente probablemente comparable con la MDH dependiente de calcio (Mxa-MDH), ampliamente estudiada.

La reconstrucción metabólica en la Fig. 5 presenta la ruta completa del MAG para oxidar formaldehído para formar a través de la ruta dependiente de 5,6,7,8-tetrahidrometanopterina, además de la formiato deshidrogenasa, que puede oxidar el formiato a CO280. El CO2 puede ser asimilado a través del Ciclo de Calvin, la única vía de fijación de C encontrada en este genoma y en otros Metilomirabilales conocidos80,85. En consecuencia, no existe el ciclo de la serina para la asimilación de formaldehído. Utilizando cultivos de enriquecimiento y experimentos de rastreo de isótopos de carbono, Rasigraf et al. (2014)85 demostraron que la M. oxyfera metanotrófica asimilaba 13 CO2 exógeno, cuando se le proporcionaba CH4, lo que indica una fijación autótrofa de CO2. Surge la pregunta de si estos homólogos metilotrofos no metanotróficos también podrían asimilar CO2 exógeno (y no sólo de la degradación del formaldehído). Considerando la amplia distribución de estos organismos en los sedimentos de aguas profundas de la pendiente de la Cuenca de Santos presentada en nuestro estudio, esto podría representar un proceso de producción primaria pasado por alto en el área. Sin embargo, sería necesaria una demostración experimental de esta capacidad.

Predicción del modelo de metabolismos SB_MAG_00001. El modelo incluye capacidades potenciales relacionadas con los metabolismos del metanol, el nitrógeno (N) y el azufre (S), así como los transportadores ABC y las adaptaciones al medio ambiente. El modelo se construyó con los genes anotados por DRAM, las proteínas predichas anotadas por GhostKoala y las búsquedas del modelo oculto de Markov (HMM) (Tabla complementaria 8).

Los microorganismos que habitan en los sedimentos del talud continental pueden soportar una amplia gama de condiciones, incluidos ambientes oligotróficos, bajas temperaturas y altas presiones hidrostáticas (HHP). Tales condiciones pueden seleccionar organismos con nichos adecuados y, al explorar el potencial metabólico de SB_MAG_00001, podríamos arrojar luz sobre la ecología y la adaptación de este microorganismo. Vivir en sedimentos oligotróficos exige estrategias metabólicas para hacer frente a recursos escasos y oscilantes. En este sentido, la metilotrofia podría representar un rasgo ventajoso, considerando que los compuestos C1 son omnipresentes en el océano86,87,88,89. Además del metanol, otros compuestos C1 como metano, haluros de metilo, aminas metiladas y compuestos de azufre metilados también se encuentran comúnmente en el medio marino89,90. Los estudios han sugerido la importancia de los microorganismos metilotróficos para el recambio de estos compuestos C1 y que la actividad microbiana previene su acumulación en los sedimentos marinos91,92.

Además del sustrato de carbono, las capacidades metabólicas relacionadas con el ciclo de los nutrientes pueden revelar estrategias ecológicas para combinar con la disponibilidad de compuestos reducidos y aceptores de electrones. Por ejemplo, SB_MAG_00001 contiene genes para el primer paso de la reducción y desnitrificación disimilatoria de nitrato (narGH), vías utilizadas como vías respiratorias alternativas en niveles bajos de oxígeno por varios microorganismos93,94. Además, también están presentes nxrAB, implicado en la oxidación de nitritos, y el gen hao, que convierte la hidroxilamina en nitrito. En cuanto al ciclo del azufre, se anotaron genes relacionados con la reducción asimilatoria de sulfato (ASR) (sat, cysN, cysC, sir, cysK) y la oxidación de tiosulfato (sox, doxD). La ASR es una ruta metabólica fundamental, ya que el azufre es un elemento esencial en todos los organismos presentes en biomoléculas, como los aminoácidos95. Además, el tiosulfato puede ser un intermediario importante en el ciclo del azufre en los sedimentos marinos y podría generarse a partir de la oxidación anóxica de los sulfuros96.

En cuanto al metabolismo del fósforo, se detectaron genes que codifican para la polifosfato quinasa (PPK) y la exopolifosfatasa (PPX). Estas enzimas son responsables de la acumulación y degradación de pólipos, una característica que puede conferir una ventaja en ambientes con alta oscilación en la disponibilidad de fosfato y otros tipos de estrés97,98. Además, la presencia del gen para el transporte de fosfonato (phnD) indica un uso potencial de fósforo orgánico. Además de phnD, otros transportadores proporcionaron algunas indicaciones de la ecofisiología potencial de este metilotrofo, incluidos los transportadores de hierro, glutamato/aspartato, fosfolípidos/colesterol/gamma-HCH, aminoácidos y tungstato (Fig. 5).

En las condiciones de las profundidades marinas, las adaptaciones a estilos de vida psicrófilos y piezófilos pueden conferir ventajas. Nuestros puntos de muestreo oscilaron entre 433 y 747 m de profundidad, donde las temperaturas del agua pueden ser tan bajas como 5 °C para la masa de agua intermedia antártica28. Algunos rasgos, como la expresión de proteínas de choque y de frío, pueden desempeñar funciones clave en el fondo marino frío99. SB_MAG_00001 contiene genes cspA y rhlB, que codifican la proteína de choque por frío y la proteína A de caja muerta de choque por frío, respectivamente, y se ha sugerido que tienen un papel en la adaptación a las condiciones de frío100,101.

Uno de los principales hallazgos en las adaptaciones celulares a condiciones de alta presión hidrostática es la acumulación de solutos en las bacterias, que pueden desempeñar el papel de un "piezolito" que actúa como solutos estabilizadores de proteínas102. La acumulación de solutos estabilizadores de proteínas, como el β-hidroxibutirato (PHB), se observa a menudo en organismos que viven bajo HHP94. La polihidroxialcanoato sintasa (phaC), un gen relacionado con la biosíntesis de PHB, está presente en SB_MAG_00001. Los solutos compatibles pueden conferir resistencia a múltiples tensiones, incluida la presión hidrostática y osmótica103. Otros genes relacionados con solutos compatibles se encontraron en SB_MAG_00001: la proteína de absorción de potasio del sistema trk y el catión monovalente: antiportador H+, y la familia CPA1 mrp, para el eflujo de sodio. Los genes para la proteína periplásmica del sistema de transporte tipo TRAP (yiaO) y la síntesis de trehalosa (otsAB) parecen estar presentes sólo en el grupo CSP1-5, mientras que el sistema de transporte osmoprotector (opuBC) y los canales mecanosensibles (ybiO) también se encuentran en los genomas de los Methylomirabilales metanotróficos.

Estudiamos las comunidades procarióticas en sedimentos de campos de pockmark y diapiros salados del Vertiente Continental en la Cuenca de Santos. Utilizando una combinación de enfoques metagenómicos y de códigos de barras asociados con herramientas filogenéticas, observamos que un metilotrofo no metanotrófico del orden Methylomirabilales estaba extendido en todas las muestras y fue el MAG de mayor calidad recuperado. Exploramos el potencial metabólico de este genoma (clasificado en la familia CSP1-5) y describimos su capacidad de oxidación de metanol, junto con varios genes con el potencial de mejorar la aptitud del organismo en el ambiente de las profundidades marinas. La naturaleza extendida de este organismo sugiere un papel potencialmente importante del metabolismo del metanol en esta zona del talud continental. Además, discutimos si podría contener una vía autótrofa de fijación de CO2 que se pasa por alto.

Los resultados también proporcionan evidencia de que los estudios basados únicamente en códigos de metabarras pueden conducir a una clasificación errónea de los miembros de Mmethylomirabilales, lo que tiene profunda relevancia para las conclusiones sobre las funciones de los organismos en el medio ambiente, ya que el orden contiene metanotróficos (Methylomirabilaceae) y no- miembros metanotróficos (CSP1–5). Se recuperaron secuencias ribosómicas erróneamente clasificadas como Methylomirabilaceae de varios entornos y, por lo tanto, la relevancia del metabolismo del metanol puede descuidarse en estudios previos.

Los datos de secuenciación del gen 16S rRNA están disponibles en los archivos de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica con el ID de BioProject PRJNA818533. Las secuencias sin procesar del metagenoma están disponibles en el repositorio de GenBank con el ID de BioProject PRJNA818670. El MAG SB_MAG_00001 se depositó en Figshare en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20080031.

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Agradecemos a Rosa Gamba (LECOM-IO/USP) y Raissa Basti Ramos (LAMA -IO/USP) por el muestreo y el apoyo científico. Agradecemos al capitán y a la tripulación del B/V Alpha-Crucis (IO-USP, Proceso FAPESP número 2010/06147-5) por apoyar el muestreo de sedimentos y a la iniciativa Censo de Vida Profunda del Deep Carbon Observatory por su apoyo con la secuenciación del metagenoma. Estamos muy agradecidos por el apoyo de Frederick Colwell y la asistencia de Mitch Sogin, Joseph Vineis, Andrew Voorhis y Hilary Morrison de MBL. Este estudio fue financiado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Becas: 2014/08266-2 y 2020/14356-5); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código de Finanzas 001 (beca de doctorado FVP) y Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), beca 300962/2018-5 (MM de M).

Departamento de Oceanografía Biológica, Instituto Oceanográfico, Universidad de São Paulo, Praça do Oceanographic, 191, São Paulo, CEP: 05508-120, Brasil

Francielli V. Peres, Fabiana S. Paula, Amanda G. Bendia & Vivian H. Pellizari

Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Centro de Energía Nuclear en Agricultura, Universidad de São Paulo, Piracicaba, Brasil

Julia B. Gontijo

Departamento de Oceanografía Física, Química y Geológica, Instituto Oceanográfico, Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil

Michel M. de Mahiques

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MMdM y VHP diseñaron el estudio y recogieron las muestras. FVP, realizó los experimentos de laboratorio. FVP, FSP, JBG y AGB analizaron y discutieron los datos. FVP y FSP escribieron el primer borrador. Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito.

Correspondencia a Fabiana S. Paula.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Peres, FV, Paula, FS, Bendia, AG et al. La evaluación de las comunidades procarióticas en los sedimentos de aguas profundas del Atlántico sudoccidental revela una prevalencia de metilomirabilales oxidantes de metanol. Informe científico 13, 12782 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39415-9

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Recibido: 12 de agosto de 2022

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39415-9

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