La resistencia al inhibidor mutante de la isocitrato deshidrogenasa 1, ivosidenib, puede superarse mediante un dímero alternativo

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 4785 (2022) Citar este artículo

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Ivosidenib, un inhibidor de las variantes R132C y R132H de la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), está aprobado para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA). Ha surgido resistencia a ivosidenib debido a una mutación en un segundo sitio de IDH1 R132C, que conduce a IDH1 R132C/S280F. Describimos estudios bioquímicos, cristalográficos y celulares sobre las variantes IDH1 R132C/S280F y R132H/S280F que informan sobre el mecanismo de resistencia en el segundo sitio, que implica tanto la modulación de la unión del inhibidor en la interfaz del dímero IDH1 como la alteración de las propiedades cinéticas. que permiten una producción más eficiente de 2-HG en relación con IDH1 R132C e IDH1 R132H. Es importante destacar que los resultados bioquímicos y celulares demuestran que debería ser posible superar la resistencia mediada por S280F en pacientes con leucemia mieloide aguda mediante el uso de inhibidores alternativos, incluidos algunos que se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase 2.

Se sabe desde hace mucho tiempo que las células cancerosas tienen el potencial de alterar el metabolismo1, pero sólo recientemente se ha aprovechado este conocimiento para obtener beneficios terapéuticos1,2,3. En los seres humanos, existen tres isoformas de isocitrato deshidrogenasa (IDH1-3), que catalizan la conversión de isocitrato para dar 2-oxoglutarato (2-OG); IDH1/2 emplea NADP+ como cofactor, mientras que IDH3, que forma parte del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), utiliza NAD+4,5. Varias mutaciones somáticas en los genes que codifican la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) y 2 (IDH2) conducen a variantes con una capacidad sustancialmente mayor para catalizar la reducción de 2-OG a 2-hidroxiglutarato (2-HG)6,7,8,9. En consecuencia, se propone que los niveles elevados de 2-HG promuevan la tumorigénesis, potencialmente a través de la desestabilización de la cromatina10. Las variantes de IDH1 más comunes en las células cancerosas son R132H y R132C11.

Se han informado múltiples inhibidores de IDH1 e IDH2, aunque solo un inhibidor de IDH1 (ivosidenib) y un inhibidor de IDH2 (enasidenib) han sido aprobados para uso clínico, es decir, para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA), donde las células cancerosas producen una variante de IDH12,13. Sin embargo, la resistencia a ivosidenib ha surgido como consecuencia de una mutación de segundo sitio que produce IDH1 R132C/S280F, habiéndose notificado hasta la fecha 5 casos14,15,16.

La base mecanística precisa por la cual la sustitución del segundo sitio IDH1 S280F permite la resistencia a ivosidenib y sus consecuencias para la inhibición de la variante IDH1 más allá de la de ivosidenib no están claras14,15,16. Informamos estudios bioquímicos, estructurales y celulares sobre IDH1 R132C/S280F e IDH1 R132H/S280F que abordan estas preguntas. Los resultados con enzimas aisladas informan sobre el mecanismo de resistencia mediada por S280F, que implica una reducción de la unión del inhibidor en la interfaz del dímero y la alteración de las propiedades cinéticas, lo que permite una mayor producción de 2-HG en relación con IDH1 R132C o R132H. Es importante destacar que los resultados revelan que la sustitución S280F causa resistencia a ivosidenib, pero este no es el caso con varios otros inhibidores de IDH1 R132H y R132C, algunos de los cuales se encuentran en ensayos clínicos de fase 2.

Para investigar el mecanismo de la resistencia al inhibidor mediada por IDH1 S280F, utilizamos protocolos establecidos17,18 para producir formas altamente purificadas de IDH1 R132C/S280F y R132H/S280F recombinantes y, a modo de comparación, IDH1 R132C, IDH1 R132H, IDH1 de tipo salvaje (wt), IDH1. S280F (sin IDH1 R132C o R132H) e IDH1 R132H/Q277E (Figura complementaria 1a). La variante IDH1 R132H/Q277E se creó porque la resistencia adquirida al fármaco contra el inhibidor mutante IDH2 enasidenib se ha relacionado con (i) IDH2 R140Q/I319M y (ii) IDH2 R140Q/Q316E; IDH2 I319 es homólogo de IDH1 S280 y IDH2 Q316 es homólogo de IDH1 Q277 (Figura complementaria 1b/c)14. De acuerdo con estudios previos sobre IDH1 R132H y R132C, todas las proteínas recombinantes eran predominantemente diméricas en solución (Fig. 1d-f complementaria) y probablemente se copurificaron con dos moléculas de NADPH (como se informó para IDH1 wt y R132H18, y se muestra para IDH1 R132C, suplementario Figura 1 g/h). Si bien los estudios biofísicos muestran que la sustitución S280F no afecta la estructura secundaria (Figura 1i complementaria), esta sustitución mejora sustancialmente la estabilidad termodinámica de las variantes IDH1 R132C y R132H, así como de IDH1 wt (Figura 1b; Figura 1j complementaria). ). Tenga en cuenta que en el texto siguiente, todas las variantes de IDH mencionadas se basan en IDH1, salvo que se indique lo contrario.

una variante de IDH1 catalizó la oxidación de isocitrato y la reducción de 2-OG a 2-HG. b Parámetros cinéticos para variantes de IDH1 (400 nM) a partir de ajustes de curvas de regresión no lineal (error estándar de la media, n = 3). Condiciones: Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 al 0,005 % v/v y BSA 0,1 mg/ml (pH 8,0). Sombreado: temperaturas de fusión (Tms) de variantes de IDH1 medidas mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF, enzima 3 µM) o dicroísmo circular (CD, enzima 0,2 mg/ml); λ: 215 nm. Condiciones: DSF (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4); CD (fosfato de sodio 10 mM, pH 8,0). Consulte Información complementaria para obtener más detalles. c Formación de 2-HG a partir de 2-OG catalizada por variantes de IDH1 medida por 1H NMR (700 MHz; barras de error: errores estándar de la media, n = 3 réplicas independientes de experimentos de curso temporal de 1H). Condiciones: enzima 500 nM, MgCl2 10 mM, 2-OG 1,5 mM, NADPH 1,5 mM; tiempo de incubación: 12 min. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Formación de 2-HG a partir de isocitrato catalizada por variantes de IDH1 medida por RMN (700 MHz; error estándar de la media, n = 3 réplicas independientes de experimentos de curso temporal de 1H). Condiciones: enzima 750 nM, MgCl2 10 mM, isocitrato de DL 3 mM, NADP+ 1,5 mM; tiempo de incubación: 9 min. Tampón: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10%, pH 7,5. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Analizamos las actividades catalíticas de las variantes R132C/S280F y R132H/S280F, empleando 1H NMR para medir la reducción de 2-OG a 2-HG y el recambio de isocitrato en dos etapas a 2-HG (Fig. 1a/c/ d; Figura complementaria 2a/b). Debido a la naturaleza redox neutral general de las dos reacciones involucradas en la conversión de isocitrato a 2-HG, esta conversión no puede monitorearse fácilmente mediante mediciones de NADP+/NADPH18. Como se anticipó, los resultados de RMN muestran que el D-isocitrato es un sustrato para R132C/S280F y R132H/S280F (Figura complementaria 2c). En particular, revelan que tanto R132C/S280F como R132H/S280F catalizan la conversión de isocitrato a 2-HG y de 2-OG a 2-HG de manera más eficiente que R132C o R132H, respectivamente. (Figura 1c/d)

Los análisis cinéticos con R132C/S280F y R132H/S280F que monitorean el consumo de NADPH mediante espectroscopia UV (Fig. 1b) demostraron que la sustitución de S280F aumenta la eficiencia catalítica (medida en kcat/KM) para la conversión de 2-OG a 2-HG, en comparación a las variantes análogas R132C y R132H, con valores de KM disminuidos tanto para 2-OG como para Mg2+. En contraste con estas variantes, la variante R132H/Q277E, que es predominantemente dimérica y que tiene una estructura secundaria similar en comparación con las otras variantes de IDH estudiadas (Figuras complementarias 1d-f, i), fue inactiva mediante ensayos de RMN 1H (Figuras complementarias 1d-f, i). Fig. 2d/e) y es menos estable que el R132H (Fig. 1j complementaria; Fig. 1b). Los estudios de fluorimetría diferencial de barrido (DSF) que utilizan N-oxalilglicina (NOG) como análogo de 2-OG catalíticamente inactivo19,20 e isocitrato (con Mg2+ 10 mM), indican que R132H/Q277E no se une, al menos de manera eficiente, a NOG o isocitrato. , probablemente reflejando su inactividad (Figura complementaria 2f).

Los análisis cinéticos que miden el consumo de NADP+ para la variante S280F (sin las sustituciones R132C o R132H) para la conversión de isocitrato a 2-OG (Tabla complementaria 1a) muestran una mayor eficiencia (kcat/KM) en comparación con IDH1 wt como resultado de una disminución de KM para isocitrato; no hubo cambios en el KM aparente para Mg2+. Sin embargo, con la variante IDH1 S280F, los valores de KM para 2-OG y Mg2+ (100 veces) disminuyeron para la conversión de 2-OG a 2-HG (Tabla complementaria 1b), mientras que el kcat disminuyó 10 veces en comparación. a IDH1 peso. Los resultados cinéticos para las conversiones de isocitrato y 2-OG medidas a través del recambio de NADP+ o NADPH son ampliamente consistentes con los ensayos de recambio de 1H NMR (Figuras complementarias 3a a f). Los resultados que muestran que la sustitución de S280F disminuye los valores de KM para ambos sustratos y Mg2+ (aparte de la conversión de isocitrato a 2-OG catalizada por IDH1 S280F) son notables porque trabajos recientes han demostrado que la unión de la interfaz del dímero alostérico de los inhibidores de la variante IDH1 dificulta tanto la unión del Mg2+ como del sustrato18.

Para investigar más a fondo las consecuencias mecanísticas de la sustitución de S280F, estudiamos las variantes de IDH1 utilizando voltamperometría cíclica (Figura complementaria 3g-l), que puede medir tasas en cada dirección del ciclo de NADP (H) y que puede distinguir la conversión de isocitrato a 2. -OG de la reducción de 2-OG a 2-HG17. Los resultados implican que R132C y R132C/S280F catalizan la conversión de isocitrato a 2-OG con una eficiencia similar (Figura complementaria 3g/h). Sin embargo, la eficiencia de la conversión general de isocitrato a 2-HG mejora para R132C / S280F en comparación con R132C (Fig. 1d), y la tasa de conversión de 2-OG a 2-HG se duplica aproximadamente en comparación con IDH1 R132C (Suplementario Figura 3g/h). Los resultados de la voltamperometría cíclica muestran que, en comparación con R132H, R132H/S280F muestra una mayor eficiencia (aproximadamente el doble), tanto para la conversión de isocitrato a 2-OG como de 2-OG a 2-HG (Figura complementaria 3i/j). IDH1 S280F (sin R132C o R132H) muestra una velocidad de reacción dos veces mayor en comparación con IDH1 wt para la conversión de isocitrato a 2-OG (Figura complementaria 3k/l).

En general, aunque los tres ensayos de recambio que miden la absorbancia de NADPH, las resonancias de RMN de 1H o los parámetros de voltametría cíclica emplearon condiciones diferentes, todos muestran que la sustitución de S280F mejora la eficiencia de las variantes R132C y R132H en la conversión de isocitrato en 2-HG, principalmente al aumentar la tasa de reducción de 2-OG a 2-HG.

Estudios anteriores han demostrado que la mayoría de los inhibidores de la variante IDH, probablemente incluido ivosidenib (no se ha informado de una estructura cristalina para ivosidenib formando un complejo con una variante IDH1), se unen a la interfaz del dímero IDH1/IDH221,22,23,24,25,26. Recientemente hemos demostrado que la interrupción de la unión de Mg2+ mediada por inhibidores se produce de una manera que afecta desproporcionadamente la conversión de 2-OG a 2-HG, en comparación con la reacción de tipo salvaje de isocitrato a 2-OG18. De acuerdo con resultados anteriores utilizando NOG e isocitrato, los análisis DSF implican que se requiere Mg2+ para la unión eficiente de isocitrato y 2-OG a R132C, R132C/S280F, R132H y R132H/S280F (Figura complementaria 3m/n). Es posible que la sustitución S280F aumente la afinidad de unión a Mg2+, al menos para la conversión catalizada por R132C/R132H de 2-OG a 2-HG.

Luego investigamos la inhibición de R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F aislados por ivosidenib (Fig. 2a; Fig. Suplementaria 4a). Los análisis de RMN y EM demuestran que la sustitución S280F reduce la eficacia de unión de ivosidenib (Fig. 2b) y que la estequiometría de la unión de ivosidenib es una molécula inhibidora por dímero (Fig. 2c); Estas observaciones son consistentes con trabajos previos sobre la inhibición de IDH1 wt y R132H por parte de ivosidenib18. Se ha propuesto, basándose en estudios de modelización15,16, que la resistencia a ivosidenib está mediada por un impedimento en la unión del inhibidor debido a la sustitución de S280 por una fenilalanina con mayor exigencia estérica (S280F), y que la unión de ivosidenib se ve obstaculizada adicionalmente por la pérdida de una enlace de hidrógeno a la cadena lateral de alcohol de S28016. Para investigar si la resistencia está mediada únicamente por impedimento estérico o si participan otros factores, incluidos los relacionados con una posible pérdida de un enlace de hidrógeno con S280, produjimos R132C/S280A. Ivosidenib no inhibe (al menos eficientemente) R132C/S280F o R132H/S280F (Fig. 2a), pero inhibe R132C/S280A con una IC50 992 nM, en comparación con una IC50 2,5 nM para R132C (Fig. 4b complementaria). Esta observación sugiere que el impedimento estérico por la cadena lateral de fenilalanina y la pérdida de un enlace de hidrógeno con S280 pueden contribuir a la resistencia a ivosidenib (R132C/S280A se inhibe menos potente que R132C mientras que no hay inhibición de R132C/S280F) (Fig. 2a ; Figura complementaria 4b). Esta propuesta es consistente con los estudios de unión de inhibidores que emplean MS no desnaturalizante y CPMG NMR (Fig. 2b), que muestran una disminución en la afinidad de R132C/S280A por ivosidenib en comparación con R132C, pero que la disminución es más sustancial para R132C/S280F. (Figura 2b).

a Inhibición (%) de variantes de IDH1 (400 nM) por ivosidenib (10 µM) según lo determinado por el ensayo de absorbancia de NADPH. Errores: errores estándar de la media (n = 3 réplicas independientes medidas en la misma placa de 96 pocillos). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b KD determinadas mediante MS no desnaturalizante (enzima 20 µM, errores técnicos: n = 3 para z = 19, 20, 21 estados de carga) y utilizando la secuencia de RMN de pulso del Proyecto CPMG (enzima 10 µM, n = 2). MS no desnaturalizante: tampón citrato de amonio (200 mM, pH 7,5); CPMG RMN: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10 %, pH 7,5. c Análisis de EM no desnaturalizante que mide la unión de ivosidenib a variantes de IDH1. A 20 µM, las variantes de IDH1 son predominantemente diméricas con 2 moléculas de NADP(H) unidas (línea discontinua). El fondo verde corresponde a la unión de una molécula de ivosidenib. Concentraciones finales de ivosidenib: 5 m (4:1), 20 m (1:1) y 160 m (1:8). Voltaje del cono: 100 V.

Los resultados combinados muestran que la sustitución S280F debilita la unión de ivosidenib y promueve la conversión de 2-OG en 2-HG. En particular, la sustitución del segundo sitio S280F también promueve, al menos en comparación con las sustituciones únicas R132C o R132H, la conversión de isocitrato a 2-HG en ausencia de inhibidor (Fig. 1d). Curiosamente, IDH1 S280F (sin R132C o R132H) ha aumentado la eficiencia catalítica para el recambio de isocitrato a 2-OG, pero no para la reducción de 2-OG a 2-HG en comparación con IDH1 wt (Tabla complementaria 1a/b; Fig. 3k/l), lo que sugiere una posible cooperación entre los dos sitios de sustitución con respecto al aumento de la eficacia de la conversión general de isocitrato en 2-HG. Tanto para el isocitrato como para el 2-OG, la unión del sustrato (según lo juzgado por KM) aumenta en IDH1 S280F (Tabla complementaria 1a/b). Para la reducción de 2-OG a 2-HG, la KM de Mg2+ para IDH1 S280F disminuye 100 veces en comparación con IDH1 wt, mientras que no cambia para la conversión de isocitrato a 2-OG. Estas observaciones combinadas implican que la sustitución S280F promueve la unión del sustrato (isocitrato o 2-OG), pero los efectos sobre la unión de Mg2+ dependen de la reacción catalizada, es decir, isocitrato a 2-OG o 2-OG a 2-HG. Esta conclusión es consistente con trabajos recientes que muestran que la unión de sustratos y Mg2+ a variantes de IDH1 implica cambios conformacionales, incluidos movimientos de las hélices α (α9 y α10) que participan en la formación de la interfaz del dímero18; Tenga en cuenta que hay evidencia de que IDH1 manifiesta reactividad en la mitad del sitio27. En particular, ivosidenib y, al menos, algunos otros inhibidores de variantes de IDH también pueden unirse a IDH1 wt (y probablemente a IDH2 wt), pero no los inhiben de manera eficiente18. Estas observaciones ilustran la complejidad de la dinámica conformacional en la interfaz del dímero IDH1 y cómo están vinculadas a la química del sitio activo. Estos sutiles problemas mecanísticos, incluida la posible modulación del Mg2+ y la unión del sustrato, hacen que sea difícil predecir con precisión cómo se manifestará la unión del ligando alostérico en el sitio de la interfaz del dímero en términos de inhibición. Por lo tanto, seleccionamos un conjunto de 14 inhibidores de variantes de IDH informados contra R132C/S280F y R132H/S280F con enzimas aisladas (Figura complementaria 4a/c).

Es importante destacar que, aunque siete de los inhibidores no manifestaron inhibición de R132C/S280F o R132H/S280F (incluido uno, SYC-435, que se une al sitio activo28), los resultados de la detección (Fig. 4c complementaria) revelaron que siete de los Los inhibidores mantuvieron actividad contra las variantes dobles, es decir, GSK321, GSK864, IDH224, IDH305, IDH556, FT-2102 y DS-1001B. Algunos de estos inhibidores manifiestan una alta potencia (CI50 <100 nM), es decir, IDH224, FT-2102 (solo contra R132H/S280F) y DS-1001B (Fig. 3a). Se seleccionaron inhibidores potentes representativos de cada serie de inhibidores para estudios adicionales (es decir, GSK864, IDH224, FT-2102, DS-1001B). Sorprendentemente, los estudios de EM no desnaturalizantes mostraron que todos estos inhibidores pueden unirse con una estequiometría de 2 moléculas a cada dímero IDH1 (Fig. 3b; Fig. complementaria 4d). Tenga en cuenta que esta observación contrasta con la de ivosidenib, donde solo se observó que una molécula inhibidora se unía al dímero IDH1 (Fig. 2c). La afinidad de unión del inhibidor (determinada por MS no desnaturalizante) fue generalmente menor para R132C/S280F y R132H/S280F que para R132C y R132H, respectivamente, aunque no está alterada para FT-2102 (Fig. 3c). El inhibidor más potente de R132C/S280F, DS-1001B, también se analizó en un ensayo en solución (empleando CPMG NMR) y se encontró que manifestaba una unión estrecha a todas las variantes probadas, con la afinidad más baja por R132H/S280F (KD = 4,19 µM). ) en comparación con las otras variantes de IDH1 probadas (Fig. 3c).

a valores de IC50 (error estándar de la media, n = 3) con variantes de IDH1 (a 30 nM); ni = no se observó inhibición. Condiciones: Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 al 0,005 % v/v y BSA 0,1 mg/ml (pH 8,0). b Análisis de MS no desnaturalizantes. Línea discontinua: dímero IDH1 (z = 20, con 2 moléculas de NADP(H) unidas), el sombreado verde corresponde a la unión de una molécula inhibidora, el sombreado menta corresponde a la unión de 2 moléculas inhibidoras. Condiciones: variante IDH1 20 µM, inhibidor 20 µM, voltaje de cono: 100 V. c Determinaciones de KD (errores estándar de la media) medidas mediante MS no desnaturalizante (enzima 20 µM, errores técnicos: n = 3 para z = 19, 20, 21 estados de carga) y CPMG NMR (valores entre paréntesis, enzima 10 µM, n = 2). MS no desnaturalizante: tampón citrato de amonio (200 mM, pH 7,5); CPMG RMN: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10 %, pH 7,5.

Los ensayos de rotación que emplean el ensayo de absorbancia de NADPH implican que la inhibición de R132C, R132C/S280F, R132H y R132H/S280F es aparentemente competitiva con respecto a los niveles de Mg2+ y 2-OG; la potencia del inhibidor no se vio sustancialmente influenciada por las variaciones en las concentraciones de NADPH, excepto potencialmente con FT-2102 (Figuras complementarias 5a-c).

Para investigar más a fondo los efectos de la sustitución de S280F en la unión del inhibidor, trabajamos para adquirir información cristalográfica y obtuvimos una estructura de R132C/S280F complejada con calcio, 2-OG y NADPH (resolución de 2,1 Å, grupo espacial: C2221, tres moléculas (A –C) en la unidad asimétrica (Figura complementaria 6a), PDB: 7PJM; la estructura se resolvió utilizando una estructura reportada de R132H, como modelo de búsqueda19; Figuras 4a-d).

una vista de cinta desde una estructura cristalina de R132C/S280F (PDB: 7PJM, resolución de 2,1 Å). Como se observa en la unidad asimétrica, un dímero aparente está formado por la cadena A (trigo) y la cadena B (verde). Círculos naranjas: sitios activos con 2-OG, NADPH y calcio. Bucle L1: violeta. b Vista de primer plano con un mapa de omisión de pólder (malla azul, contorno 3,0 σ) que muestra 2-OG, NADPH y calcio. El bucle L1 que cubre la interfaz del dímero está en violeta. Círculo negro: interfaz de dímero con un mapa de omisión de Polder (malla azul, contorno: 3,0 σ) que muestra F280 (cian). c Vista de la interfaz del dímero que destaca las interacciones hidrofóbicas entre W124 (L1), F280 (cian, α10) y W267 en ambos monómeros. d Vista del sitio de encuadernación de metal. Se muestran los residuos de unión a calcio D252 (monómero 1, trigo, α9), D275 y D279 (monómero 2, verde, α10). e Vista de cinta desde una estructura cristalina de R132C/S280F (PDB: 7PJN), resolución de 2,45 Å) complejada con 2 moléculas de NADPH y 2 DS-1001B (naranja); Es probable que la enzima esté en una conformación abierta e inactiva. Un dímero aparente está formado por la cadena B (trigo) y la cadena C (verde), como se observa en la unidad asimétrica. DS-1001B se une a la interfaz del dímero (círculo negro). f Polder omite el mapa (malla azul, contorno: 3,0 σ) que muestra DS-1001B y el residuo F280 (cian) en la interfaz del dímero. Tenga en cuenta que el bucle L1 (violeta) cubre la interfaz del dímero.

La comparación con las estructuras IDH1 reportadas19,29 implica que la estructura R132C/S280F probablemente refleja una conformación de sitio activo cerrado (los anchos de las dos hendiduras del sitio activo en el homodímero aparente formado por las cadenas A y B medidas por las distancias entre I76 y L250, que son residuos en la entrada del sitio activo29, son 12,6 Å y 13,0 Å, lo que indica una conformación cerrada29 (Figura complementaria 6b/c). La estructura revela que los anillos de fenilo de los dos residuos S280F, ubicados en α10, son adyacentes entre sí en la interfaz del dímero (Fig. 4a/b); junto con las cadenas laterales de W124 y W267, el grupo fenilo de S280F crea una región hidrófoba aumentada en la interfaz del dímero (Fig. 4c), lo que posiblemente refleja el aumento de la estabilidad térmica de las variantes de S280F (Fig. 1b; Fig. 1j complementaria). .

En la estructura R132C/S280F, es notable que el bucle L1, que cubre parcialmente el bolsillo de unión del inhibidor30 (Fig. 4b; Fig. complementaria 7a/b), adopta una conformación diferente en comparación con la observada en una estructura cristalina R132H complejada con calcio, 2-OG y NADPH19. Aunque la diferencia en la conformación del bucle L1 podría reflejar (en parte) diferentes condiciones de cristalización, esta observación respalda la importancia de los movimientos conformacionales durante la catálisis y la inhibición de IDH1. Además, existen diferencias en la conformación del residuo de unión a metal Asp-252 (Fig. 4d; Fig. complementaria 7c/d) en la estructura R132C/S280F en comparación con las observadas en otras estructuras, incluido R132H19. Sin embargo, la naturaleza general de la unión de 2-OG, que incluye la quelación por el ion calcio, no cambia en las diferentes estructuras (Figura complementaria 7d).

Obtuvimos una estructura cristalina de R132C/S280F complejada con NADPH y su potente inhibidor DS-1001B (resolución de 2,45 Å, grupo espacial: P21212, cuatro moléculas (A – D) en la unidad asimétrica (Figura complementaria 8a), PDB: 7PJN La estructura se resolvió utilizando una estructura unida a inhibidor de R132H como modelo de búsqueda31 (Fig. 4e/f). De acuerdo con los resultados de la EM no desnaturalizante (Fig. 3b), la estructura revela dos moléculas de DS-1001B unidas a la interfaz del dímero (Fig. 4e). Curiosamente, las dos moléculas DS-1001B se unen de tal manera que sus anillos de triclorofenilo son adyacentes, una observación de interés con respecto a futuros esfuerzos de química medicinal destinados a mejorar la unión del inhibidor (Fig. 4f). La estructura compleja DS-1001B probablemente refleja una conformación abierta o semiabierta (inactiva): los anchos de las dos hendiduras del sitio activo en el homodímero aparente formado por la cadena B y la cadena C, medido por las distancias entre I76 y L250, son 17,7 Å. (semiabierto) y 20,2 Å (abierto; Fig. complementaria 8b/c). Como se informó anteriormente para la conformación inactiva23, α10 en ambos monómeros está parcialmente desordenado y asume una conformación de bucle parcial (Figura complementaria 9), lo que potencialmente ayuda a acomodar la unión del inhibidor. En particular, en contraste con la estructura de R132C/S280F sin inhibidor, en la estructura complejada DS-1001B, los residuos S280F de los dos monómeros no son adyacentes sino separados por 14,9 Å (átomo de C más cercano, figura complementaria 10).

Aunque se debe tener cuidado de no sobreinterpretar las diferencias en las estructuras cristalinas obtenidas en diferentes condiciones, de acuerdo con los estudios de solución, nuestros resultados cristalográficos muestran que la sustitución S280F afecta la química en la interfaz del dímero donde probablemente se une ivosidenib y que tiene potencial. afectar la química del sitio activo, incluso con respecto a la unión de iones metálicos y, como consecuencia, la unión del sustrato. Cuando se combinan con otras estructuras y estudios cinéticos y biofísicos recientes18,27, estos resultados biofísicos resaltan aún más el papel de la dinámica conformacional y la complejidad en la catálisis IDH (variante). Definir la naturaleza precisa de estos y sus efectos de inhibición es un desafío y requiere estudios estructurales sobre rotaciones individuales junto con modelos. Por lo tanto, proponemos que la inhibición de la variante IDH, incluso con respecto a la lucha contra las resistencias, debería perseguirse principalmente mediante un enfoque guiado empíricamente que emplee diferentes tipos de ensayos de recambio y unión vinculados a estudios celulares en una etapa temprana.

El respaldo a este enfoque proviene de los resultados de estudios celulares sobre cinco inhibidores seleccionados (potenciales) de R132C/S280F, es decir, ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102 y DS-1001B (Fig. 5). Se usó una línea celular de glioblastoma LN-18 (ATTC CRL-2610) para producir variantes de IDH1 recombinantes (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) como se informa en la figura complementaria 11.

Las células LN18 se trataron con los inhibidores ivosidenib, GSK864, FT-2102, IDH224 y DS-1001B en DMSO (concentración final: 5 µM). Los niveles de 2-HG se determinaron mediante cromatografía de intercambio aniónico acoplada a MS51 (errores: errores estándar de la media, n = 4 réplicas independientes). Tenga en cuenta que, si bien ivosidenib no es activo o es poco activo para reducir los niveles de 2-HG en las células portadoras de R132C/S280F y R132H/S280F, los otros inhibidores son activos para reducir los niveles de 2-HG. Las células de control se generaron mediante transducción con vectores lentivirales que no contenían IDH1. Gráficos de caja y bigotes: la línea central es la mediana y los límites son los valores de los percentiles 25 y 75. Los bigotes son los niveles mínimos y máximos medidos de 2-HG para cada grupo experimental. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se anticipó, con las células de control, que no expresan ninguna variante de IDH1, los inhibidores no tuvieron ningún efecto detectable, dentro del error, sobre los bajos niveles de 2-HG endógeno presente (Fig. 5). De acuerdo con los resultados informados24,26,32, todos los inhibidores suprimieron eficientemente la producción de 2-HG en células que sobreproducían R132C y R132H. Por el contrario, los efectos de los cinco inhibidores sobre las células que producen en exceso R132C/S280F o R132H/S280F variaron. De acuerdo con los datos bioquímicos que muestran que la sustitución de S280F causa resistencia a ivosidenib y con resultados clínicos previos14,15,16, ivosidenib fue ineficaz para suprimir la producción de 2-HG en las células sobreproductoras R132C/S280F y R132H/S280F (Fig. 5). En las células superproductoras R132C/S280F, GSK864 fue sólo moderadamente potente para reducir los niveles de 2-HG, mientras que IDH224, DS-1001B y FT-2102 fueron más potentes para reducir los niveles de 2-HG. Curiosamente, FT-2102 fue relativamente menos potente que IDH224 y DS-1001B contra R132C/S280F aislado (Fig. 3a; IC50 1,3 µM). La potencia relativamente alta de FT-2102 en las células puede reflejar una mayor permeabilidad celular en comparación con IDH224 y DS-1001B.

En el caso de R132H/S280F (Fig. 5), los resultados para el tratamiento con ivosidenib, GSK864, IDH224 y FT-2102 fueron análogos a los de las células portadoras de R132C/S280F. Sin embargo, sorprendentemente, DS-1001B fue un inhibidor relativamente pobre de R132H/S280F en este contexto celular. Esta diferencia probablemente refleja, al menos en parte, la IC50 más alta para DS-1001B versus R132H/S280F aislado en comparación con los valores de las otras variantes de IDH1 probadas (Fig. 3a).

Aunque existen diferencias en las eficiencias relativas de los inhibidores, como se describió anteriormente, los resultados celulares se correlacionan bien con los resultados de las variantes aisladas de IDH1. Lo más importante es que revelan que inhibidores específicos, incluidos FT-2102 y DS-1001B, que se encuentran en ensayos clínicos de fase 233,34,35, son eficaces para reducir los niveles de 2-HG en las células portadoras de R132C/S280F.

El desarrollo de inhibidores de la variante IDH es un gran avance en el tratamiento del cáncer, ya que es un ejemplo pionero de cómo los fármacos de molécula pequeña pueden atacar con éxito el metabolismo. Sin embargo, como se anticipó, ha surgido resistencia al fármaco pionero ivosidenib, en particular, a través de la sustitución S280F en la interfaz del dímero14,15,16. Los resultados de la detección de inhibidores con variantes IDH1 aisladas revelan que ni las variantes R132C/S280F ni R132H/S280F son inhibidas (eficientemente) por ivosidenib. Sin embargo, es importante destacar que este resultado también es válido para algunos, pero no todos, de los inhibidores de variantes de IDH reportados actualmente en desarrollo. Por lo tanto, debería ser posible superar la resistencia a los inhibidores de las variantes de IDH causada por mutantes de la interfaz del dímero mediante programas de química medicinal adecuados.

Los resultados bioquímicos y estructurales combinados muestran que la sustitución S280F permite la resistencia a ivosidenib en células cancerosas que producen R132C/S280F o R132H/S280F, en parte al impedir su unión a la interfaz del dímero IDH1 y en parte al aumentar la eficiencia de las variantes R132C y R132H. en catalizar la conversión de isocitrato y/o 2-OG en 2-HG. Los estudios reportados aquí y en otros lugares18 implican que la unión alostérica de los inhibidores variantes de IDH en la interfaz del dímero afecta la unión del sitio activo Mg2+ (o el complejo Mg2+-sustrato en el caso del isocitrato) de una manera que inhibe desproporcionadamente la conversión de 2-OG a 2-HG. en comparación con la conversión de isocitrato a 2-OG. Las razones moleculares precisas de estas observaciones, junto con los detalles de la catálisis de IDH1 wt, deberían ser objeto de futuros estudios biofísicos resueltos en el tiempo.

Aunque se desconoce la relevancia del cáncer in vivo del aumento observado en la eficiencia catalítica de R132C S280F in vitro, puede ayudar a mantener niveles elevados de 2-HG en presencia de una variante inhibidora de IDH. Si es así, respalda un papel funcional del 2-HG en células cancerosas maduras y, en consecuencia, un tratamiento basado en inhibidores que da como resultado una reducción de los niveles de 2-HG; tenga en cuenta que el papel de 2-HG en las células cancerosas maduras puede ser diferente o adicional al papel propuesto de los niveles elevados de 2-HG en la tumorigénesis36,37.

A pesar de la complejidad mecanística de la inhibición de la variante IDH1 mediante unión alostérica, nuestros resultados muestran claramente que la resistencia mediada por R132C/S280F a ivosidenib se puede superar mediante el uso de otros inhibidores, por ejemplo, IDH224, FT-2102, DS-1001B y probablemente variantes mejoradas de estos. . Al igual que ivosidenib, estos inhibidores también se unen a la interfaz del dímero; sin embargo, a diferencia de ivosidenib, que se une con una estequiometría de una molécula inhibidora por dímero variante IDH1, los potentes inhibidores R132C/S280F (como lo demuestran los estudios bioquímicos y celulares) se unen con una estequiometría de dos moléculas inhibidoras por dímero, como lo demuestran los estudios no desnaturalizantes. Estudios de MS y análisis cristalográficos de R132C/S280F con y sin inhibidor. Es importante destacar que dos inhibidores de R132C/S280F y R132H/S280F, FT-2102 y DS-1001B, ya se encuentran en ensayos clínicos de fase 233,34,35. Por tanto, existe la posibilidad de desarrollar regímenes de tratamiento eficaces que impliquen la sustitución de una variante del inhibidor de IDH por otra a medida que surja resistencia. También existe la posibilidad de utilizar combinaciones de inhibidores, en particular cuando los tipos de resistencia que probablemente surgirán pueden predecirse antes del tratamiento inicial.

Estudios recientes sobre los mecanismos de IDH1 y sus variantes y el modo de acción de los inhibidores de variantes de IDH reportados18 han llevado a sugerir que los inhibidores alostéricos se identificaron preferentemente en parte como consecuencia de las condiciones de detección utilizadas, es decir, las pruebas de detección no se llevaron a cabo con concentraciones variadas de Mg2+. La naturaleza de S280F permitió la resistencia de ivosidenib a R132C/S280F sugiere que es de interés el desarrollo de nuevos tipos de inhibidores de IDH, incluidos aquellos que no funcionan mediante unión alostérica a la interfaz del dímero. Es posible que la unión de inhibidores en la interfaz del dímero IDH, que está involucrada en cambios conformacionales sutiles durante la catálisis, pueda ser particularmente propensa a la resistencia en comparación con aquellos que se unen en el sitio activo y/o compiten con NADPH. Sin embargo, cabe señalar que la sustitución S280F confiere resistencia a un inhibidor, SYC-435, que se une al sitio activo IDH128.

Debido a los limitados datos clínicos disponibles en esta etapa, es difícil predecir cómo surgirá la resistencia a los inhibidores de la variante IDH. Por lo tanto, sugerimos que, junto con la optimización de los inhibidores actualmente eficaces, que se unen en la interfaz del dímero, vale la pena desarrollar inhibidores variantes de IDH que funcionen a través de mecanismos que no impliquen la unión alostérica. Nuestros resultados también implican que los futuros esfuerzos de química medicinal deberían emplear de manera óptima múltiples variantes de IDH1/2, incluidas mutaciones que permitan la resistencia en forma aislada (bajo diferentes condiciones de ensayo), así como análisis celulares e in vivo guiados empíricamente.

Se diseñaron cebadores directos e inversos para introducir diferentes mutaciones de acuerdo con los procedimientos informados38. Se utilizó como plantilla un plásmido pET22b (Sigma-Aldrich). IDH1 R132H/S280F y R132C se elaboraron a partir de una plantilla de ADN IDH1 R132H (obtenida como se describe 18). IDH1 R132C/S280F y R132C/S280A se elaboraron a partir de una plantilla de ADN R132C. IDH1 S280F se preparó a partir de una plantilla de ADN natural de IDH1. Las reacciones se realizaron (método de 2 pasos) utilizando la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® (New England Biolabs), una mezcla de solución de desoxinucleótidos (New England Biolabs) y un GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). La mezcla se purificó utilizando el kit de purificación por PCR GeneJET (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. El ADN molde se digirió usando Dpn1 (New England Biolabs; 3 h de incubación, 37 °C). El producto se transformó en células XL10-gold (Agilent). Las colonias se cultivaron durante la noche en 10 ml de medio 2TY y el plásmido se extrajo utilizando el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Los plásmidos se eluyeron con agua purificada MilliQ. Las secuencias fueron confirmadas mediante secuenciación de Sanger realizada por Eurofins Scientific.

La producción de proteínas recombinantes se realizó como se describe17,18. En resumen, las proteínas recombinantes se produjeron en células BL21 (DE3) plysS E. coli con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM con una temperatura posterior a la inducción de 20 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lisaron mediante sonicación. Los lisados celulares se cargaron en una columna HisTrap HP de 5 ml (Cytiva) y se eluyeron con un gradiente escalonado de imidazol (hasta 500 mM). Las fracciones que contenían la proteína deseada se purificaron adicionalmente utilizando una columna Superdex S200 (GE Healthcare, 300 ml) mediante elución isocrática. La pureza de las fracciones se evaluó mediante electroforesis en gel SDS PAGE (Figura complementaria 1a). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando una máquina Nanodrop One (Thermo Scientific) y corresponden a la concentración del monómero IDH1.

Para los estudios cristalográficos, se purificó adicionalmente IDH1 R132C/S280F mediante cromatografía de intercambio aniónico. Después de la purificación inicial usando una columna HisTrap HP de 5 ml (Cytiva), las fracciones que contenían la proteína deseada se sometieron a intercambio de tampón usando una columna PD-10 (Merck) y se cargaron en una columna Cytiva Q Sepharose Fast Flow. La proteína se eluyó con un gradiente de NaCl (hasta 1 M) y luego se sometió a purificación por filtración en gel (columna Superdex S200 (GE Healthcare, 300 ml), con elución isocrática utilizando un tampón que contenía Tris 20 mM y NaCl 100 mM (pH 7,4).

Para experimentos electroquímicos, se produjo ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) de Chlamydomonas reinhardtii como se describe39. En resumen, se produjo FNR recombinante en células BL21(DE3)plysS E. coli añadiendo IPTG 1 mM, y los cultivos se cultivaron durante 4 h más (37 °C). Las células se recogieron mediante centrifugación; Los sedimentos se resuspendieron en un pequeño volumen de tampón frío (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM; pH 7,4) y se almacenaron durante la noche a -80 °C. Las células se descongelaron y se lisaron usando una prensa francesa a 20 psi, y el lisado se centrifugó a 4 °C usando una ultracentrífuga (Beckman L8-70M Ultracentrifuge). Se aisló FNR del sobrenadante usando una columna de afinidad Ni2+ HisTrap HP (GE Healthcare Life Sciences) y se eluyó de la columna usando un gradiente de imidazol (concentración final de imidazol 250 mM). Las fracciones que contenían FNR se seleccionaron basándose en la absorbancia a 280 nm y 460 nm. Las fracciones que contenían FNR se combinaron y concentraron usando filtros centrífugos Amicon Ultra-4 ml (10 kDa) hasta un volumen final de aproximadamente 2 ml. Luego se aplicó la solución concentrada de FNR a una columna de desalinización (PD-10; GE Healthcare) para eliminar el imidazol. La enzima se separó en alícuotas de un solo uso, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y luego se almacenó a -80 °C.

La cinética enzimática se determinó espectrofotométricamente en función de los cambios en la concentración de NADPH medida por su absorción a 340 nm (ε = 6220 M–1 cm–1). Los análisis se realizaron en placas de microtitulación transparentes de media área de 96 pocillos (Greiner Bio-One 675001) utilizando un lector de microplacas PHERAstar FS a 25 °C en un volumen de reacción de 100 µl. Este ensayo se utilizó para estudiar la cinética en estado estacionario y la inhibición de reacciones catalizadas por variantes de IDH1. El tampón de ensayo fue Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 0,2 mM, Tween 20 al 0,005 % (v/v) y albúmina sérica bovina (BSA) 0,1 mg ml-1 (pH 8,0). Para los ensayos de inhibición, las variantes de IDH1 se incubaron con un inhibidor durante 12 minutos antes de que se iniciara la reacción mediante la adición de sustrato. El error estándar se derivó del ajuste de curvas utilizando GraphPad Prism v9. Consulte las leyendas de las figuras para obtener detalles sobre ensayos cinéticos específicos (Figs. 1 a 3; Fig. 5 complementaria; Tabla 1 complementaria).

La sal disódica de 2-oxoglutarato (2-OG), la sal tetrasódica de NADPH (~98%), la sal disódica de NADP+, la sal de potasio de D-isocitrato y MgCl2 × 6 H2O eran de Sigma-Aldrich. La sal trisódica del ácido DL-isocítrico era de ChemCruz. Los inhibidores eran de MedChemExpress, BioVision, DC Chemicals, Sigma-Aldrich, Enzo Life Sciences, Cambridge Bioscience Ltd. GSK321 y GSK864 fueron proporcionados amablemente por GSK. Se prepararon soluciones madre en DMSO (10 mM).

Las variantes de IDH1 se intercambiaron en tampón de RMN (Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, D2O al 10%, pH 7,5) utilizando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se obtuvieron utilizando un espectrómetro de RMN Bruker AVIII de 700 MHz equipado con una criosonda TCI 1H/13C/15N inversa de 5 mm. Se agregaron MgCl2 (10 mM), isocitrato/2-OG y NADP+/NADPH para los ensayos de recambio, y el recambio se controló mediante RMN 1H (NS: 16, retraso de relajación: 2 s). La señal de agua fue suprimida mediante escultura de excitación. Los datos se analizaron utilizando Mestrenova.

Las variantes de IDH1 se intercambiaron en tampón de RMN (Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, D2O al 10 %, pH 7,5) y se concentraron utilizando filtros centrífugos ultra Amicon (0,5 ml, corte: 50 kDa) según el protocolo del fabricante. Los experimentos se realizaron con inhibidor 10 µM (de una solución madre de d6-DMSO 10 mM). La variante IDH1 se tituló en esta solución y se aplicó la secuencia PROJECT-CPMG40. Los parámetros experimentales fueron los siguientes: tiempo total de eco, 40 ms; retraso de relajación, 2 s. La supresión del agua se logró mediante presaturación. El porcentaje de complejo proteína-inhibidor ([PL]/([P] + [PL]) se representó frente a la concentración de inhibidor. Los datos se analizaron utilizando Mestrenova y la constante de disociación se calculó mediante regresión no lineal mediante GraphPad Prism (versión 9). ).

Las variantes de IDH1 se intercambiaron con tampón por tampón de fosfato sódico (10 mM, pH 8,0) utilizando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) según el protocolo del fabricante. Las mediciones de CD utilizaron un espectrómetro de CD Chirascan (Fotofísica Aplicada) equipado con un soporte de celda Peltier con temperatura controlada. Los espectros se registraron en un rango de 260 a 185 nm (intervalos de 0,5 nm). Las mediciones se realizaron por triplicado a 23 °C y el fondo se restó del de la muestra. Los espectros se promediaron y suavizaron utilizando el filtro Savitzky-Golay (tamaño de ventana 4). Los datos se normalizaron a la concentración de proteína (medida usando una máquina NanoDrop One) y la elipticidad media del residuo se calculó de acuerdo con la fórmula [Eq. 1]:

Para analizar la estabilidad térmica de las variantes de IDH1, la longitud de onda se fijó en 215 nm y la temperatura aumentó gradualmente de 10 a 80 °C. La velocidad de calentamiento fue de 1 °C min-1 y la señal de CD se midió cada 2 °C (±0,4 °C). Los espectros se suavizaron utilizando el filtro Savitzky-Golay (polinomio de cuarto orden, 12 vecinos) de GraphPad Prism (versión 9). La temperatura de fusión se calculó utilizando un modelo sigmoidal de Boltzmann con Graph Pad Prism (versión 9); el error estándar se derivó del ajuste de curvas utilizando el modelo sigmoidal de Boltzmann.

Las mediciones se realizaron en tampón Tris (50 mM, pH 7,4) con proteína 3 µM y Sypro Orange 3x en un ciclador térmico Bio-Rad CFX96. La tasa de calor fue de +0,2 °C s-1 en un rango de 20 a 95 °C. Los datos se analizaron utilizando Bio-Rad CFX Manager 3.1. El error estándar se derivó de tres réplicas independientes.

Se utilizaron geles de Tris-glicina Novex™ WedgeWell™ al 4–12 %. La cámara de gel (Invitrogen) se enfrió en un baño de hielo y la electroforesis en gel se realizó en una cámara fría (4 °C) utilizando tampón de ejecución NativePAGE (Invitrogen). La electroforesis en gel se llevó a cabo durante 1,5 h a 160 V y el gel se tiñó con InstantBlue Coomassie (Expedeon).

Las mediciones SEC-MALS se realizaron utilizando un detector de dispersión de luz de 8 ángulos Wyatt Dawn HELEOS-II y un monitor de índice de refracción Wyatt Optilab rEX conectado a un sistema HPLC Shimadzu que comprende una bomba LC-20AD, un muestreador automático SIL-20A y un detector UV/Vis SPD20A. Las muestras se analizaron con una columna Superdex 200 HR10/30 con un caudal de 0,5 ml min-1. La concentración de la muestra fue de 1 mg mL-1 en un tampón que contenía Tris (20 mM, pH 7,4) y NaCl (100 mM).

Los experimentos electroquímicos se realizaron en una caja de guantes anaeróbica (Glove Box Technology) que contenía una atmósfera de nitrógeno (O2 <1 ppm). El aparato electroquímico (una celda electroquímica de vidrio y electrodos giratorios de borde de grafito pirolítico (PGE)) fue como se informó anteriormente17. Se utilizó un potenciostato Autolab PGSTAT 10 que utiliza el software Nova para realizar experimentos electroquímicos. Los potenciales de los electrodos (E) se midieron frente a un electrodo de calomelanos saturado (SCE) y se convirtieron al electrodo de hidrógeno estándar (SHE) usando una ecuación de conversión de potencial dependiente de la temperatura (a 25 °C la conversión es: ESHE = ESCE + 0,241 V)17 . El contraelectrodo era un alambre de platino. Se fabricaron electrodos nanoporosos de óxido de indio y estaño (ITO) depositando electroforéticamente nanopartículas de ITO (<50 nm, Sigma-Aldrich) sobre electrodos de borde de grafito pirolítico (ITO/PGE)17. Las enzimas se cargaron en el electrodo arrojando una solución de enzimas mixtas de 4 a 6 µl sobre el electrodo ITO y dejándolo incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos mientras se aseguraba que la solución no se evaporara. En todos los casos, se utilizaron 0,85 nmol (base homodímero) de IDH1 (tipo salvaje y todas las variantes); la cantidad de FNR que se cocargó se ajustó para lograr la proporción enzimática final deseada. Todas las variantes neomórficas de IDH1 analizadas (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) se cargaron en una proporción molar de 2,5 a 1 con FNR (es decir, se cargó 2,5 veces más (equivalente molar de homodímero) de cada variante de IDH1 en relación con FNR para cada experimento). Por el contrario, IDH1 wt e IDH1 S280F se cargaron en una proporción molar de 1 a 8 con FNR para garantizar que el sistema no estuviera limitado por FNR debido a que estas enzimas IDH1 oxidan el isocitrato de DL a un ritmo mucho más rápido que las variantes neomórficas de IDH1. Las concentraciones de IDH1 se calcularon en función de sus homodímeros. Los electrodos cargados con enzima se enjuagaron minuciosamente usando una solución tampón antes de sumergirlos en el tampón de reacción para cada experimento para garantizar que no hubiera enzima libre en la solución.

Las variantes de IDH1 se intercambiaron con tampón MS no desnaturalizante (acetato de amonio, 200 mM, pH 7,5) utilizando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los experimentos de MS no desnaturalizante se llevaron a cabo utilizando un instrumento cuadrupolo-TOF (Waters Synapt G2Si) y un muestreador automático ESI basado en chip Advion Triversa Nanomate. Los inhibidores se disolvieron en MeOH y se agregaron a la solución de proteína (concentración final de proteína: 20 µM). Se aplicó un voltaje de pulverización de 1,7 a 1,8 kV (presión del gas de respaldo de pulverización 0,6 psi, presión de entrada 3,7 mbar). Los voltajes del cono de muestra fueron 100 V y 5,2 V. Los espectros se analizaron utilizando Mass Lynx (versión 4.1), incluido el centrado y el suavizado. El porcentaje de complejo proteína-inhibidor ([PL]/([P] + [PL]) se representó frente a la concentración de inhibidor. Se aplicó una corrección de referencia y se calculó la constante de disociación mediante regresión no lineal mediante GraphPad Prism (versión 9). ).

Se usó IDH1 R132C/S280F (25,62 mg ml-1 en Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) para la cristalización mediante el método de difusión de vapor en gota sentada. Para la configuración de caída sentada, se utilizó una placa Cryschem de 24 pocillos (Hampton Research, EE. UU.) con una solución de depósito de 250 µL19. Una pantalla que varía la concentración de PEG (PEG3350 15-20%, eje horizontal en pasos de 1%) y la concentración de sal (acetato de calcio 200 o 225 mM, eje vertical; sin semillas o sin semillas, respectivamente) y Bis-Tris (0,1 M) a pH 7 se llevó a cabo. La enzima (25 µL) se incubó durante 1 h en hielo con NADPH 10 mM (en H2O, 10 µL), CaCl2 20 mM (en H2O, 5 µL) y 2-OG 200 mM (en H2O, 10 µL) para producir una concentración final de proteína de 12,81 mg mL-1. La cristalización se logró mediante la adición de 2 µl de la solución que contiene proteína a una solución precipitante de 2 µl. Las placas se sellaron con StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Alemania); Los cristales (tamaño promedio de 100 µM) se manifestaron en 14 días. Para obtener cristales de forma reproducible, se empleó la siembra con trituración de cristales utilizando el kit SeadBeat (Hampton Research, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Las gotas que contenían cristales se crioprotegieron mezclándolas en una proporción de 1:1 con una solución de depósito que contenía glicerol (25 % (v/v)), se recogieron con un asa de nailon y se crioenfriaron en N2 líquido. Los cristales se almacenaron en N2 líquido hasta que se requirieron para la recolección de datos.

Los datos se recopilaron a 100 K utilizando la línea de luz I24 de Diamond Light Source (DLS). Los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando la estrategia Xia241 del proceso de procesamiento automático de la línea de luz (Tabla complementaria 4). La estructura cristalina de IDH1 R132C/S280F se determinó mediante reemplazo molecular (MR) utilizando la subrutina AutoMR (PHASER42) en PHENIX43. El modelo de búsqueda utilizado para MR se basó en IDH1 R132H (PDB: 4KZO19). El modelo estructural se optimizó mediante ciclos iterativos de reconstrucción manual en COOT44 y refinamiento cristalográfico en Phenix.refine45 (los detalles del refinamiento se resumen en la Tabla complementaria 4).

Para la cristalización se utilizó IDH1 R132C/S280F (25,62 mg ml-1 en Tris 20 mM, NaCl 100 mM, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 mM, pH 7,4. Para la configuración de caída sentada, se utilizó una placa Cryschem de 24 pocillos (Hampton Research, EE. UU.) con una solución de depósito de 250 µL, como se informó25. Se realizó una pantalla que variaba la concentración de citrato de amonio (pH 7,0, 0,75–2 M, eje horizontal en pasos de 0,25 M) y la concentración de DTT (1,5–3 mM, eje vertical en pasos de 0,5 mM). La proteína (12,5 µl) se incubó en hielo durante 1 h con NADPH (10 mM; en tampón que contenía Tris 20 mM, NaCl 100 mM, TCEP 1 mM, pH 7,4; 5 µl), tampón (6,8 µl) y 10 µl. -veces el exceso de DS-1001B (en DMSO, 0,7 µL) hasta una concentración final de proteína de 12,81 mg mL-1. Luego se añadieron 2 µl de esta solución a 2 µl de solución precipitante. La placa de caída se selló con StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Alemania) y los cristales aparecieron después de un día. La recolección de cristales se realizó con glicerol como crioprotector como se describió anteriormente.

Los datos se recopilaron a 100 K utilizando radiación sincrotrón en la línea de luz DLS I03. Los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando la estrategia Xia241 del proceso de procesamiento automático de la línea de luz (Tabla complementaria 4). Se obtuvo una solución de RM inicial utilizando una estructura unida a inhibidor de IDH1 R132H (PDB: 5TQH31). Se reconstruyó un modelo inicial a partir de esta solución de RM utilizando PHENIX AutoBuild45,46,47,48,49. El modelo estructural se optimizó mediante ciclos iterativos de reconstrucción manual en COOT44 y refinamiento con Phenix.refine45 (los detalles se resumen en la Tabla complementaria 4). Debido a la resolución limitada (2,45 Å), se utilizaron restricciones NCS en todo momento y refinamiento TLS de los factores B (16 grupos TLS para las cuatro cadenas).

Se obtuvieron células de glioblastoma humano LN18 de la ATCC y se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Las células LN18 se modificaron genéticamente para sobreexpresar transgenes que codifican IDH1 R132H, IDH1 R132C, IDH1 R132H/S280F o IDH1 R132C/S280F utilizando transducción de vectores lentivirales. Primero, la secuencia mutante IDH1 S280F de IDH1 se generó mediante un enfoque recombinante basado en PCR, utilizando los vectores de transferencia lentivirales pCC.sin.36.IDH1R132H.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet y pCC.sin.36.IDH1R132C.PPTWpre. .CMV.tTA-S2tet50, que contiene las secuencias R132H y R132C de IDH1, como plantillas. En esta reacción, se utilizaron Primer1_forward y Primer1_reverse (Tabla complementaria 2). Posteriormente, el amplicón mutante IDH1 S280F se subclonó en los mismos vectores de transferencia utilizando BamH1-HF y Nhe1-HF. Posteriormente, las secuencias IDH1 R132H, R132C, IDH1 R132H/S280F o IDH1 R132C/S280F se amplificaron en reacciones de PCR usando Primer2_forward y Primer2_reverse (Tabla complementaria 2) y se clonaron en el vector pUltra-Chili (AddGene), usando Xma1 y NheI- HF. Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs. Todas las transformaciones bacterianas se realizaron utilizando células ultracompetentes XL10-Gold según las instrucciones del fabricante. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger utilizando Primer3_forward y Primer3_reverse (Tabla complementaria 2).

Todos los plásmidos de transferencia pUltra-Chili mutantes IDH1 se empaquetaron en vectores lentivirales (LV) mediante transfección transitoria de células HEK293T junto con los 3 plásmidos empaquetadores: pVSVg, pREV y pMDL. Las células HEK293T se cultivaron en IMDM (Sigma, I3390) suplementado con 10% de FBS (Fisher Scientific, 11550356) y 5% de antibiótico pen-strep (Sigma, P4458). 48 h después de la transfección, se recogió el medio acondicionado HEK293T, se centrifugó y se filtró utilizando filtros de 0,22 µm. La concentración del antígeno p24 viral se midió utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima de perfil central p24 de VIH-1, ensayo ELISA Lenti-X p24 Rapid Titer kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron diluciones en serie de medio acondicionado recién cosechado para infectar 1,2 x 105 células LN18 en una placa de seis pocillos en presencia de polibreno (8 μg ml-1). Como control, las células se transdujeron con el vector lentiviral pUltra-Chili, que contenía TdTomato, pero no secuencias IDH1.

El ARN se extrajo utilizando el RNeasy Micro Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Cuando fue necesario, el ADN complementario se transcribió de forma inversa utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Se usó qPCR para medir la expresión de IDH1 en células control y transducidas con LV usando una sonda IDH1 TaqMan (Life Technologies) y TaqMan Fast Universal PCR Master-Mix (Applied Biosystems). La reacción se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 5 Dx (Applied Biosystems) con GAPDH como control endógeno (Life Technologies). La expresión de cada gen diana se evaluó utilizando un enfoque de cuantificación relativa (método 2 - ΔΔCT).

Se utilizaron solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco líquida y filtrada de forma estéril, suero bovino fetal (FBS) de origen no estadounidense y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 4500 mg L-1 de glucosa y bicarbonato de sodio, sin L-glutamina. de Merck Ciencias de la Vida. El suplemento GlutaMAXTM era de Thermo Fisher Scientific. El dimetilsulfóxido (DMSO) para biología molecular era de Merck. Los filtros de jeringa estériles (15 mm de diámetro, poro 0,2 µM, membrana RC) eran de Corning. Los inhibidores se disolvieron en DMSO hasta una concentración de 5 mM y se filtraron antes de su uso con filtros de jeringa Corning® (celulosa regenerada, 18 mm de diámetro, poros de 0,2 µm).

Se incubaron células LN18 que contenían un vector vacío o que producían IDH1 R132C, IDH1 R132C/S280F, IDH1 R132H o IDH1 R132H/S280F recombinantes a 37 °C y 5% de CO2 y se cultivaron en DMEM (4500 mg L-1 de glucosa) suplementado con 10 % (v/v) FBS y 1% (v/v) GlutaMAXTM. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos, con 0,7 ml por pocillo a 200.000 células ml-1. Después de 24 h de incubación, el medio original se reemplazó con 0,7 ml de medio nuevo (DMEM (4500 mg L-1 de glucosa), 10 % de FBS y 1 % de GlutaMAXTM) con inhibidor 5 µM (ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102). , DS-1001B) o DMSO al 0,1% (muestras de control). Las células se incubaron durante 24 h más antes de la recolección. El medio se eliminó mediante aspiración durante la recolección antes de que los pocillos se lavaran suavemente dos veces con 0,7 ml de PBS por pocillo. Se añadieron a cada pocillo 75 µl de metanol acuoso al 80 % (v/v) y la placa se colocó sobre hielo seco. Se rasparon las células y se transfirió el contenido de cada pocillo a microtubos separados.

Los extractos celulares se centrifugaron a 14.000 g durante 25 min. La concentración de ADN (ng µL-1) de los sobrenadantes se midió utilizando un ClarioStar Plus con una placa LVis (260 nm). Se añadieron 2,5 µl del sobrenadante a cada pocillo. La placa se blanqueó con 2,5 µl de metanol acuoso al 80 % (v/v) por pocillo antes de medir la concentración de ADN. El sobrenadante de la muestra de células restante se transfirió a viales de Total Recovery (Waters) y se diluyó con respecto a la concentración de ADN. El análisis de cromatografía de intercambio aniónico-MS se llevó a cabo como se informó51 utilizando un sistema de cromatografía iónica de alta presión Dionex ICS-5000+ equipado con una columna trampa regenerada continuamente, un supresor Dionex ERS 500e y AS11-HC (2 × 250 mm, 4 μm). columna, todos de Dionex (Sunnyvale, CA, EE. UU.). Esto se acopló directamente a un MS Orbitrap-cuadrupolo híbrido Q-Exactive HF a través de una sonda HESI II, ambos de Thermo Fisher. La temperatura de la columna fue de 30 °C y todas las muestras se inyectaron con una inyección de bucle parcial de 5 µl. La fase móvil eran iones de hidróxido acuosos (caudal: 0,250 ml min-1) con el siguiente gradiente: 0 min, 0 mM; 1 min, 0 mM; 15 min, 60 mM; 25 min, 100 mM; 30,1 min, 0 mM; 37 min, 0 mM. El supresor tenía un caudal de 0,500 ml min-1 y se utilizó en el modo de agua externa. El MS se hizo funcionar en modo de iones negativos con los siguientes parámetros de fuente: caudal de gas envolvente, 60; caudal de gas auxiliar, 20; caudal de gas de barrido, 0; voltaje de pulverización 3,6 kV; temperatura capilar, 300 °C; Nivel de RF de lente S, 70; temperatura del calentador, 350 °C. Los parámetros de escaneo MS y MS/MS fueron: microscans, 2; resolución, 7 × 104; Objetivo AGC, 1 × 106 iones; TI máxima, 250 ms; recuento de bucles, 10; recuento de MSX, 1; ventana de aislamiento, 2,0 m/z; energía de colisión, 35; objetivo mínimo de AGC, 5 × 103 iones; disparador del ápice 1 a 15 s; exclusión de cargos 3–8, >8; exclusión dinámica, 20,0 s. El tiempo de retención de 2-HG se determinó mediante análisis de 1 µg ml-1 de estándar en metanol acuoso al 80 % (v/v) (grado HPLC, de Sigma-Aldrich).

Los datos cristalográficos generados en este estudio se han depositado en la base de datos PDB con los códigos de acceso 7PJM y 7PJN. Los datos originales se proporcionan con este documento. Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos informados en este artículo está disponible a través de los autores correspondientes previa solicitud. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al Wellcome Trust (091857/7/10/7), al Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/L000121/1, sLoLa Grant BB/J001694/2 y BB/R013829/1), al Consejo de Investigación Médica, al Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas y Cancer Research UK (C8717/A18245) por financiar este trabajo. RR contó con el apoyo del Programa de Doctorado en Biología Química de Oxford-GSK-Crick a través del Interdisciplinary Bioscience DTP, BBSRC (BB/R506655/1) y GlaxoSmithKline. ICH agradece a la Fundación para la Educación de Anne Grete Eidsvig y Kjell Inge Røkke por una beca Aker. PR agradece a la Deutsche Akademie für Naturforscher Leopoldina, Alemania, por una beca postdoctoral. RAH agradece la financiación del Fondo Clarendon y la beca Birkett del Trinity College. Agradecemos al Dr. Victor Mikhailov por su ayuda con los estudios de EM no desnaturalizantes y al Dr. David Staunton por llevar a cabo los experimentos SEC-MALS. E. Vigna del Candiolo Cancer Institute (IRCCS) de la Universidad de Turín, Italia, nos proporcionó amablemente las células HEK293T y los vectores de empaquetado lentivirales pMDL, pVSVg y pREV. Agradecemos al personal de Diamond Light Source UK por el tiempo de emisión y el apoyo en las líneas de luz I03 e I24 (propuesta MX-23459).

James madera y melissa morgan

Dirección actual: Instituto de Genética y Cáncer, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Martine I. Abboud

Dirección actual: Departamento de Ciencias Naturales, Universidad Libanesa Americana, Byblos/Beirut, Líbano

Estos autores contribuyeron igualmente: Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe.

Laboratorio de Investigación de Química, Departamento de Química e Instituto Ineos de Oxford para la Investigación de Antimicrobianos, Universidad de Oxford, 12 Mansfield, Oxford, OX1 3TA, Reino Unido

Raphael Reinbold, Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe, Ian J. Clifton, James SO McCullagh, Martine I. Abboud y Christopher J. Schofield

Departamento de Química, Universidad de Oxford, Oxford, OX1 3QR, Reino Unido

Ryan A. Herold y Fraser A. Armstrong

Instituto de Cáncer y Ciencias Genómicas, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Alina Finch, James Wood, Melissa Morgan y Chiara Bardella

Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Friburgo, 79104, Friburgo, Alemania

Maximiliano Staudt

GlaxoSmithKline, Gunnels Wood Rd, Stevenage, SG1 2NY, Reino Unido

Sí Redmond

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CJS y MIA diseñaron el estudio. RR, MIA y MS produjeron las proteínas. RR realizó ensayos de absorbancia UV, estudios de RMN 1H, estudios de CD, estudios DSF y análisis de geles no desnaturalizantes. RR y PR realizaron estudios cristalográficos. IJC apoyó el análisis de datos cristalográficos. RR realizó estudios de EM no desnaturalizantes. RAH y FAA realizaron experimentos electroquímicos. AF, JW y MM produjeron y clonaron los vectores mutantes IDH. CB y AF generaron los LV, las células mutantes IDH y realizaron validaciones. ICH y JSOM completaron el tratamiento inhibidor de líneas celulares y el análisis metabolómico. JR apoyó experimentos de inhibición. RR y CJS coescribieron el artículo. Todos los autores revisaron el artículo.

Correspondencia a Martine I. Abboud o Christopher J. Schofield.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Christal Sohl y a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Reinbold, R., Hvinden, IC, Rabe, P. et al. La resistencia al inhibidor mutante de la isocitrato deshidrogenasa 1, ivosidenib, puede superarse mediante inhibidores alternativos de unión a la interfaz del dímero. Nat Comuna 13, 4785 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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Recibido: 11 de abril de 2022

Aceptado: 25 de julio de 2022

Publicado: 15 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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