Aceleración nanoplasmónica de la amplificación de ácidos nucleicos para la detección de patógenos.

Nature Nanotechnology volumen 18, páginas 846–847 (2023)Cite este artículo

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Se ha demostrado que un sistema automatizado que combina microfluidos con inyección plasmónica de electrones calientes para acelerar la detección colorimétrica de la amplificación de ADN y ARN logra una precisión de detección del 95% en muestras de saliva humana. Esta técnica utiliza diferentes ensayos de amplificación para la identificación de patógenos y puede diferenciar entre variantes y subtipos virales.

Los largos protocolos involucrados con los ensayos basados ​​en la detección y replicación de ácidos nucleicos a través de sondas de ácidos nucleicos (ensayos de amplificación) dificultan la detección rápida de patógenos en el punto necesario, y mucho menos la automatización del proceso desde la preparación de la muestra hasta el resultado1. Esta restricción dificulta la toma de decisiones sobre la gestión de la propagación de infecciones respiratorias virales que, debido a su creciente incidencia, afectan cada vez más a la población y la economía mundial. Estas limitaciones se pusieron de relieve especialmente en las primeras etapas de la pandemia de COVID-19, cuando hubo un esfuerzo mundial para desarrollar y utilizar pruebas de diagnóstico. Actualmente, las pruebas de antígenos son las pruebas preferidas para los entornos en los que se necesitan debido a su funcionamiento sencillo y rápido. Sin embargo, las pruebas de antígenos tienen menor sensibilidad que las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)2, lo que dificulta su aplicabilidad para informar la toma de decisiones sanitarias al inicio de la infección.

Proponemos una técnica, QolorEX, para obtener una lectura colorimétrica cuantitativa sin etiquetas con una resolución de un solo nucleótido, que puede obtener un resultado en cuestión de minutos. Este enfoque integra ensayos colorimétricos de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) y amplificación de círculo rodante (RCA) basados ​​en rojo de fenol con microfluidos de nanosuperficie plasmónica miniaturizada para lograr la catálisis de punto caliente plasmónico. Para agilizar la reacción de amplificación, desarrollamos un cartucho de microfluidos que utiliza una actuación de microfluidos ajustable y dependiente del ángulo para integrar el ciclo completo de recolección de muestras, lisis, adición de reactivos de ensayo, amplificación de ácidos nucleicos y detección (Fig. 1a). Para reducir los errores introducidos por el usuario, desarrollamos una caja de imágenes acoplada a iluminación con actuadores automatizados para manipular, calentar y obtener imágenes del cartucho de microfluidos sin necesidad de intervención del usuario. Esta automatización permite al usuario tocar un botón en una aplicación de teléfono móvil para comenzar la operación secuencial del cartucho de microfluidos. La lectura colorimétrica es detectada automáticamente por la cámara complementaria de semiconductor de óxido metálico (CMOS) integrada con la caja de imágenes. Luego, un algoritmo de aprendizaje automático analiza la lectura y establece resultados positivos o negativos; Luego, el resultado se envía al teléfono móvil del usuario.

a, Un esquema del funcionamiento de QolorEX. El usuario escupe saliva en el embudo de recolección y coloca el cartucho de microfluidos dentro de la caja de imágenes. Luego, los resultados se transmiten automáticamente a través de una aplicación de teléfono inteligente. b, Tras la excitación de la luz, el nanomaterial plasmónico acelera el ensayo de amplificación debido al exceso de electrones en la interfaz de reacción. El aumento de la tasa de amplificación aumenta la tasa de producción de protones, lo que disminuye el pH del medio, lo que hace que el rojo de fenol cambie rápidamente de color de fucsia a amarillo en presencia del patógeno objetivo (que se muestra en el recuadro). dNTP, trifosfato de desoxirribonucleótido; DOS, densidad de estados; E, energía; EF, energía de Fermi; ensayo, energía de inicio de reacción de oxidación; ħω, energía del fotón; ΔV, volumen de la cámara de detección. © 2023, AbdElFatah, T. et al.

Demostramos que la lectura colorimétrica rápida obtenida con QolorEX depende en gran medida de la inyección de electrones "calientes" excitados por la luz desde la superficie de nanopartículas plasmónicas autoensambladas en la mezcla de muestra y reactivos de ensayo en la cámara de detección. Estos electrones calientes aceleran la reacción nucleofílica en el paso de polimerización de la amplificación, lo que a su vez da como resultado la transformación de color libre de etiquetas dependiente del pH del rojo de fenol de fucsia a amarillo (Fig. 1b). Descubrimos que las superficies plasmónicas con nanopartículas de 400 nm de diámetro ofrecían una mayor mejora del campo electromagnético y efectos de catálisis de puntos calientes plasmónicos asociados que las superficies plasmónicas con otros tamaños de nanopartículas, lo que resultó en una aceleración de 9 veces en la velocidad de reacción de amplificación en promedio.

Validamos el sistema QolorEX utilizando varios virus y bacterias respiratorios. También demostramos que QolorEX puede diferenciar entre (sub)variantes del SARS-CoV-2 a nivel de polimorfismo de un solo nucleótido. Además, QolorEX tiene un límite de detección de 5 copias de ARN por microlitro, lo que permite un diagnóstico preciso desde el inicio de la infección cuando las cargas virales son bajas. También analizamos 33 muestras de saliva humana positivas para SARS-CoV-2 y 15 negativas. Para estas muestras, QolorEX logró un tiempo de muestra a respuesta de 13 minutos con una precisión del 95%, que es comparable a la prueba de PCR cuantitativa estándar de oro. La participación limitada del usuario, la alta precisión, la sensibilidad, la automatización y la rapidez de QolorEX significan que esta técnica podría abordar la necesidad de pruebas de grado PCR en entornos remotos.

QolorEX es verdaderamente una plataforma versátil. Aunque lo probamos con ensayos colorimétricos LAMP y RCA, podría funcionar con cualquier ensayo colorimétrico de amplificación de ácido nucleico. Además, QolorEX puede detectar cualquier objetivo de ácido nucleico y no se limita únicamente a virus y bacterias. En el futuro, QolorEX podría integrarse con diferentes ensayos de amplificación o utilizarse para investigar nuevas aplicaciones, como estudios medioambientales, pruebas de alimentos y el descubrimiento y evaluación de la eficacia de fármacos.

Actualmente, QolorEX requiere medios de muestra transparentes para permitir la detección de señales colorimétricas. Por lo tanto, se necesita un mayor desarrollo para permitir la incorporación y prueba de medios opacos como sangre completa y muestras de heces. Además, el enfoque actual utiliza tintes sensibles al pH para la lectura colorimétrica, lo que limita el rango de pH de las muestras que se pueden analizar.

Tamer AbdElFatah, Mahsa Jalali y Sara Mahshid

Universidad McGill, Montreal, Quebec, Canadá.

“Este trabajo presenta un paquete completo que combina microfluidos, electrónica y mecanismos de transducción nanoplasmónicos con una sólida evaluación en el laboratorio del dispositivo utilizando varios virus y bacterias clínicamente relevantes. Los autores utilizan el estudio de bioensayo para distinguir con éxito entre infección bacteriana y viral en cuestión de minutos, lo cual es una aplicación importante y extremadamente difícil de lograr”. Nikhil Bhalla, Universidad de Ulster, Belfast, Reino Unido.

A principios de 2020, discutimos la idea de la lectura colorimétrica mejorada plasmónica y la integración con microfluidos. Fue durante el confinamiento cuando nos topamos por primera vez con los ensayos RT-LAMP y tuvimos la idea de utilizar una lectura colorimétrica mejorada plasmónica para facilitar el diagnóstico de COVID-19. ¡Desde el principio, logramos tiempos de detección más rápidos y límites de detección más bajos que el trabajo original3! Sin embargo, no sabíamos cuál era la fuente de esta mejora. Durante seis meses, revisamos la literatura de varias disciplinas. Un día, T.AF. se topó con un estudio de la reacción nucleofílica que ocurre durante la amplificación del ADN5. Precisamente el día anterior habíamos discutido la idea de la inyección de electrones desde la superficie de los materiales plasmónicos bajo excitación luminosa. Nos preguntamos si los electrones inyectados podrían acelerar la reacción de amplificación. Confirmar esta hipótesis requirió muchas validaciones experimentales. Sin embargo, nunca olvidaremos esa sensación cuando todo encajó. T.AF., MJ y SM

“El trabajo de AbdelFatah et al. presenta un paquete de mesa que combina transducción nanoplasmónica, microfluidos y una lectura de señales colorimétricas para teléfonos inteligentes con salida cuantitativa y es un paso hacia el desarrollo de una plataforma de diagnóstico molecular modular automatizada. Además, el estudio demuestra la sólida distinción entre virus patógenos clínicamente relevantes e infección bacteriana en cuestión de minutos, lo que abre oportunidades para implementar y adoptar dichas tecnologías en entornos con recursos limitados”. Raghavendra Palankar, editor asociado, Nature Nanotechnology.

Wang, C. y col. Diagnóstico en el lugar de atención para enfermedades infecciosas: de los métodos a los dispositivos. Nano Hoy 37, 101092 (2021). Un artículo de revisión que presenta varias pruebas de diagnóstico en el lugar de atención.

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Este es un resumen de: AbdElFatah, T. et al. La amplificación nanoplasmónica en microfluidos permite la cuantificación colorimétrica acelerada de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos. Nat. Nanotecnología. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01384-5 (2023).

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Aceleración nanoplasmónica de la amplificación de ácidos nucleicos para la detección de patógenos. Nat. Nanotecnología. 18, 846–847 (2023). https://doi.org/10.1038/s41565-023-01398-z

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Publicado: 05 de junio de 2023

Fecha de emisión: agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-023-01398-z

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