Detección sensible de poliovirus mediante PCR anidada y secuenciación de nanoporos: un estudio de validación prospectivo

Nature Microbiology volumen 8, páginas 1634–1640 (2023)Cite este artículo

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La detección oportuna de los brotes es necesaria para la erradicación del poliovirus, pero la detección estándar en la República Democrática del Congo tarda 30 días (mediana). La detección molecular directa y la secuenciación de nanoporos (DDNS) de poliovirus en muestras de heces es un método rápido y prometedor. Aquí informamos pruebas prospectivas de muestras de heces de casos sospechosos de polio y sus contactos en la República Democrática del Congo entre el 10 de agosto de 2021 y el 4 de febrero de 2022. La DDNS detectó poliovirus en 62/2339 (2,7%) de las muestras, mientras que el estándar de oro La combinación de cultivo celular, PCR cuantitativa y secuenciación de Sanger detectó poliovirus en 51/2.339 (2,2%) de las mismas muestras. La DDNS proporcionó confirmación de casos en 7 días (mediana) en condiciones de vigilancia de rutina. La DDNS permitió la confirmación de tres brotes circulantes de poliovirus derivados de la vacuna del serotipo 2 23 días (media) antes (rango de 6 a 30 días) que el método estándar de oro. La similitud de secuencia media entre las secuencias obtenidas mediante los dos métodos fue del 99,98%. Nuestros datos confirman la viabilidad de implementar DDNS en un laboratorio nacional de poliovirus.

A pesar de los importantes avances logrados por la Iniciativa Mundial para la Erradicación de la Polio (GPEI), desde su creación en 1988, la poliomielitis sigue siendo un importante problema de salud pública en países con baja cobertura de vacunación. Durante los brotes de poliovirus se utilizan campañas de vacunación masiva con vacuna oral contra la polio (OPV) para detener la transmisión. Sin embargo, una combinación de envío lento de muestras de heces, aislamiento del virus que requiere mucho tiempo mediante cultivos celulares y capacidad de secuenciación insuficiente retrasa las respuestas a los brotes y reduce el impacto de las campañas de vacunación masiva1,2,3.

En agosto de 2020, se declaró que la Región de África había interrumpido la transmisión del poliovirus salvaje (WPV)4. La vacunación con OPV ha provocado brotes de poliovirus circulante derivado de la vacuna (cVDPV), que se produce por la reversión de mutaciones atenuantes en la cepa de la vacuna viva. Las cepas vacunales vivas se eliminan en las heces después de la vacunación y pueden propagarse en poblaciones poco inmunizadas; las mutaciones atenuantes se pierden con el tiempo5,6. Las epidemias de cVDPV del serotipo 2 (cVDPV2) en niños pequeños azotan a África y Asia occidental en esta era posterior al WPV. En 2020, se notificaron 959 casos de parálisis causada por cVDPV2 en 27 países, incluidos 21 países de África7; En 2021, se notificaron 692 casos causados por cVDPV2 y 20 casos por cVDPV del serotipo 1 en todo el mundo, principalmente en África, incluidas Nigeria y la República Democrática del Congo (RDC)8. En 2022 se notificaron al menos 843 casos de VDPV, 502 de los cuales se produjeron en la República Democrática del Congo8.

En la República Democrática del Congo, 10 años después del último caso de WPV, ha habido una circulación casi continua de cVDPV2 como resultado de la aparición de cVDPV2 tras el uso de OPV de serotipo 2 en respuesta a los brotes existentes. Las respuestas se ven obstaculizadas por una vigilancia inadecuada y los largos plazos hasta que se confirman los brotes. La vigilancia del poliovirus se basa en la recolección de muestras de heces de niños con parálisis fláccida aguda (PFA) y de sus contactos, y en muestreos ambientales (de aguas residuales). La vigilancia eficaz del poliovirus depende de la recolección de muestras y pruebas de laboratorio de alta calidad. Las heces recolectadas de un caso de PFA se consideran adecuadas para la prueba si se recolectan dos heces con 48 h de diferencia, dentro de las 2 semanas posteriores al inicio de la parálisis, y llegan por cadena de frío con la documentación adecuada. En la República Democrática del Congo, la proporción de casos de PFA con recolección inadecuada de muestras de heces fue del 23% en 2018 (ref. 8). Además, los desafíos logísticos en el envío de muestras al laboratorio, en las pruebas de laboratorio de las muestras y en el envío internacional (a Sudáfrica) para su secuenciación provocan retrasos en la detección de brotes de poliovirus. Se ha estimado que el número de casos de un brote aumenta aproximadamente un 12% (intervalo de credibilidad del 95%: 5-21%) por semana adicional9 (promedio de los datos de la Región de África) debido a estos problemas logísticos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) identificó los retrasos en la detección como uno de los principales desafíos que enfrenta el programa de erradicación de la polio10.

La República Democrática del Congo tiene una superficie de 2.345.000 km², pero sólo tiene un laboratorio acreditado por la OMS, el Instituto Nacional de Investigación Biomédica (INRB) en Kinshasa, que es responsable del diagnóstico biológico del poliovirus en todo el país. El INRB utiliza un protocolo de detección sensible y estandarizado de la OMS que combina el cultivo celular con la PCR cuantitativa (qPCR) de diferenciación intratípica (ITD). La secuenciación de la región de la cápside VP1 del poliovirus se lleva a cabo en un laboratorio separado en la República de Sudáfrica, y se requiere una secuencia VP1 para confirmar la detección o los casos de poliovirus y para distinguir el cVDPV de las cepas vacunales.

La GPEI está considerando actualmente qué enfoques utilizar para lograr la erradicación de la polio en los dos últimos países endémicos del WPV, Afganistán y Pakistán, y para combatir los brotes de cVDPV en cuatro de las seis regiones geográficas de la OMS3. La Estrategia de Erradicación de la Polio de la OMS 2022-2026 (ref. 3) se comprometió a mejorar la detección y la respuesta. Esto incluye la detección directa del poliovirus en muestras de heces, eliminando así la necesidad del algoritmo de detección basado en cultivos celulares de acuerdo con los objetivos mundiales de contención del poliovirus11, y el traslado de las pruebas del poliovirus y el análisis de secuencias al nivel nacional.

Estas mejoras en la detección y respuesta podrían lograrse mediante la implementación de un método de detección molecular directa y secuenciación de nanoporos (DDNS)12. DDNS combina la detección rápida y directa a partir de muestras de heces con la secuenciación in situ, evitando el transporte internacional de muestras y permitiendo una respuesta rápida a los brotes9. Podría implementarse en cualquier laboratorio que ya utilice PCR, incluido INRB, en el que se han utilizado Illumina y secuenciación de nanoporos para el virus del Ébola, el sarampión, la viruela símica y el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (refs. 13, 14).

En este artículo, para validar la implementación de DDNS para que pueda ser considerado como un método recomendado por la Red Mundial de Laboratorios de Polio (GPLN) de la OMS15, llevamos a cabo un estudio prospectivo en la República Democrática del Congo para evaluar la aplicación del protocolo DDNS y lo comparamos con el oro. métodos estándar de cultivo celular para la vigilancia del poliovirus. Aquí informamos la sensibilidad y especificidad de DDNS en comparación con el cultivo celular, la precisión de la secuenciación, el tiempo necesario en el laboratorio y los datos de costos asociados.

Las muestras de heces se analizaron en paralelo utilizando tanto el DDNS como el ensayo estándar de oro. Se procesaron un total de 2339 muestras de heces prospectivas, de 1159 casos de AFP (cada uno con 1 o 2 muestras) y 62 contactos de casos o muestras comunitarias (cada 1 muestra), utilizando 26 secuenciaciones de nanoporos en un período de 141 días, en promedio una secuenciación. cada 5,4 días. La DDNS identificó 62 muestras (2,7% del total de muestras) como positivas para poliovirus, con 36 cVDPV2 (1,58%), 5 Sabin serotipo 1 (0,30%), 19 Sabin serotipo 3 (0,90%) y 2 que contenían los serotipos 1 y 3 Sabin. poliovirus (0,09 %) (Tabla 1). El ensayo estándar de oro identificó poliovirus en 51 muestras, de las cuales 31 muestras eran serotipo 2 VDPV (1,33%), 4 eran Sabin serotipo 1 (0,17%) y 16 eran Sabin serotipo 3 (0,68%).

La sensibilidad y especificidad de la detección para cada tipo de poliovirus para DDNS o el ensayo estándar de oro actual se presentan en la Tabla 2. El cVDPV2 detectado por cualquiera de los métodos no fue contaminación porque las secuencias diferían de las de otras muestras (como se muestra en la Figura 1 complementaria). La sensibilidad y especificidad de los dos métodos no difirieron significativamente (prueba exacta de Fisher).

Se dispuso de dos muestras de heces de 1.118 casos de PFA, con 37 casos positivos para poliovirus por cualquiera de los métodos. Dieciocho casos tuvieron concordancia total entre ambos métodos y ambas muestras dieron positivo (Tabla complementaria 1). No hubo casos en los que ambas muestras dieron positivo en el ensayo estándar de oro y no arrojaron ningún resultado DDNS positivo, mientras que en nueve casos con resultados DDNS positivos no se detectó poliovirus en el ensayo estándar de oro.

Se dispuso de una sola muestra o un par de muestras para 1.159 casos de PFA. La sensibilidad y especificidad de la detección se calcularon para cada caso de PFA (Tabla 3), y solo para los casos de PFA en los que había dos heces disponibles (n = 1118 casos; Tabla complementaria 2).

Durante este período de estudio, se secuenció la región VP1 de 27 muestras que contenían VDPV2 utilizando ambos métodos de diagnóstico. Solo las muestras de importancia programática (donde puede ser necesaria una respuesta de vacunación; todos los virus de serotipo 2 y cualquier poliovirus sospechoso de ser derivado de la vacuna y de tipo salvaje) se secuencian después del cultivo celular, mientras que DDNS produce una secuencia para muestras positivas sin requerir secuenciación adicional en otro lugar. Para estas 27 muestras se requirió una mediana de 6 días entre el inicio del caso y la recolección de la muestra (rango de 2 a 21 días) y una mediana adicional de 6 días entre la recolección de la muestra y la llegada de las muestras al laboratorio de secuenciación (rango de 2 a 27 días) . El tiempo transcurrido desde la recepción en el laboratorio de secuenciación hasta la secuencia de VP1 tomó una media de 30 días (rango de 21 a 41 días) mediante el algoritmo estándar, incluida una mediana de 8 días (rango de 4 a 22 días) necesarios para el envío entre el aislamiento del virus y laboratorio de secuenciación, mientras que la DDNS fue significativamente más rápida (P <0,001, prueba U de Mann-Whitney) y requirió una mediana de 7 días (rango de 4 a 23 días) (Fig. 1).

El tiempo transcurrido entre el inicio del caso y la secuencia generada mediante DDNS y el algoritmo estándar se comparó mediante una prueba U de Mann-Whitney bilateral.

Datos fuente

Durante el período del estudio, se produjeron cuatro brotes de cVDPV2 en la provincia de Maniema, en la República Democrática del Congo, y se confirmaron mediante el algoritmo estándar de rutina. Para dos de los linajes (RDC-MAN-3 y RDC-MAN-4) la muestra confirmatoria de circulación (segundo caso) se recolectó durante el período de estudio, mientras que para RDC-MAN-2 la muestra confirmatoria se recolectó 42 días antes del estudio. período y procesado durante el entrenamiento. El algoritmo de detección estándar de oro requirió 27, 35 y 64 días, respectivamente (media 42 días), para procesar estas muestras desde la recolección hasta la secuenciación de Sanger. Estas mismas muestras fueron procesadas en 6, 20 y 30 días, respectivamente, por DDNS, a pesar de que las muestras para RDC-MAN-2 se recolectaron antes del período de estudio, una media de 23 días más rápido. Al cuarto linaje del brote, RDC-MAN-5, solo se le tomó la primera muestra positiva durante el período de estudio, pero esta muestra también arrojó una secuencia VP1 29 días antes mediante DDNS. La distribución geográfica de los casos identificados por DDNS para los cuatro brotes y la relación del linaje de brotes RDC-MAN-3 se muestra en la Fig. 2. Con base en el reloj molecular VP1 del poliovirus y estas secuencias de VP1 derivadas de DDNS, estimamos que el RDC-MAN -3 surgió de una campaña de vacunación con OPV2 realizada en el primer trimestre de 2020 (fecha media 26 de enero de 2020, densidad posterior más alta del 95 % del 4 de abril de 2019 al 16 de septiembre de 2020).

a, Casos de los cuatro linajes de Maniema detectados durante el período de estudio (Provincia de Maniema resaltada en verde). Los casos se trazan por distrito y la ubicación dentro del distrito se determina al azar. b, Árbol filogenético fechado por punta que muestra la fecha de aparición de máxima probabilidad del linaje RDC-Man-3 y su posterior diversificación a lo largo del tiempo. Las puntas sólidas indican que la detección de DDNS coincidió con una detección basada en cultivo celular de un cVDPV2 de la misma muestra. Los casos confirmados mediante secuenciación de Sanger pero sin una secuencia DDNS correspondiente (n = 2) no se incluyeron en el análisis.

Datos fuente

Cuando las secuencias consensuadas de VP1 de cVDPV2 estaban disponibles a partir de la secuenciación DDNS y Sanger del aislado de cultivo para la misma muestra, se determinó la similitud de las secuencias. La identidad media de la secuencia VP1 comparando DDNS y el algoritmo estándar de oro (incluida la secuenciación de Sanger) para los 27 cVDPV2 con resultados para ambos métodos fue del 99,98% (rango 99,60-100%). El número absoluto de diferencias entre secuencias se presenta en la Tabla 4.

Los costos de los consumibles del ensayo DDNS son de aproximadamente 20 dólares estadounidenses por muestra cuando se realizan series de secuenciación multiplexada de 96 muestras o 25 dólares por muestra cuando se realizan series de 45 muestras en laboratorios de menor rendimiento (Tabla complementaria 3). Estas cifras incluyen el tratamiento con cloroformo, la extracción de ARN, la PCR anidada y la secuenciación de nanoporos. Solo para el tratamiento con cloroformo, cultivo celular y qPCR, el algoritmo de detección basado en cultivo celular cuesta aproximadamente $31 (Tabla complementaria 3), además del costo de la secuenciación de Sanger y el envío al Instituto Nacional de Enfermedades Transmisibles (NICD) en Sudáfrica. donde se realiza la secuenciación. Si bien ambos métodos requieren algunos equipos grandes, DDNS evita los requisitos de microscopios, incubadoras, contadores de células y gabinetes de cultivo de tejidos, y solo necesita agregar un secuenciador MinION o GridION (los MinION generalmente cuestan $ 1,000, incluidos los reactivos de secuenciación). kit y una celda de flujo). Los costos de personal e instalaciones no se han incluido en las cifras, sin embargo, el desempeño del DDNS en el INRB requirió sólo cinco miembros del personal; tres científicos de laboratorio para la extracción de ARN, transcripción inversa (RT) anidada (RT) –PCR y secuenciación de nanoporos y dos bioinformáticos/administradores de datos para realizar el control de calidad de los datos y hacer coincidir las secuencias con los datos de los casos. Pasos comparables del algoritmo basado en cultivo celular requieren cuatro científicos de laboratorio para cultivo celular y qPCR, dos miembros del personal de apoyo para el mantenimiento de las instalaciones y el apoyo de personal de secuenciación adicional y bioinformáticos en el NICD.

Aquí presentamos un estudio de validación prospectivo que comparó DDNS con el ensayo estándar de oro para la detección de poliovirus en muestras de heces en la República Democrática del Congo. Nuestros datos confirman que la DDNS puede aplicarse como una herramienta de vigilancia rápida, sensible y rentable en la República Democrática del Congo. Nuestros resultados demuestran que es factible implementar DDNS en un laboratorio nacional de poliovirus. Aunque no cuenta con el poder estadístico para una comparación directa con el ensayo estándar de oro, nuestro estudio indica que el DDNS es al menos tan sensible como el cultivo para la detección del poliovirus.

La implementación de DDNS en este estudio muestra que detecta poliovirus más rápido que el cultivo celular. Las secuencias de DDNS VP1 para muestras positivas de VDPV2 se generaron en promedio una mediana de 14 días después de la recolección de heces. Esto es similar, pero un poco más lento, a los 12 días que predijimos al estimar el rendimiento de la DDNS en función de las recolecciones de muestras de heces de 2016 a 2020 (ref. 9). Nuestras estimaciones anteriores no tuvieron en cuenta el procesamiento por lotes de muestras para maximizar la eficiencia y minimizar los costos. Se podrían lograr mayores mejoras en la velocidad mediante la extracción automatizada de ARN, o reduciendo el tiempo de entrega de las muestras al laboratorio, tal vez mediante drones dadas las malas condiciones de las carreteras16, o mediante el establecimiento de laboratorios regionales adicionales dentro de la República Democrática del Congo.

Para las muestras necesarias para confirmar tres de los cuatro linajes de cVDPV2, DDNS generó la secuencia VP1 necesaria para iniciar una respuesta una media de 23 días (rango de 6 a 30 días) más rápido que el cultivo. La detección y respuesta tempranas a los brotes dan lugar a pocos casos y a una mayor probabilidad de truncar la transmisión en curso2,9. A pesar de la menor precisión de secuenciación de lectura bruta de los nanoporos en comparación con la secuenciación de Sanger, la generación de secuencias de consenso arrojó una similitud media del 99,98%. La identidad de secuencia fue <100% para solo 2/27 muestras. Cuando se observó una diferencia relativamente grande (la muestra con cuatro diferencias de nucleótidos entre las secuencias consenso de DDNS y la secuenciación de Sanger), esto puede representar diferentes poblaciones virales dentro del intestino del caso de AFP. En este caso se recogieron un par de muestras de heces con un día de diferencia, y las secuencias de Sanger para el par también diferían en un nucleótido. Sin embargo, mediante la eliminación del cultivo de células virales competitivas y el uso de secuenciación de próxima generación, DDNS permite la identificación de múltiples plantillas virales a partir de una sola muestra, como lo demuestra la detección de Sabin 1 y Sabin 3 en dos de las muestras. Una mejor denominación de haplotipos podría incluso permitir la resolución de poblaciones virales muy estrechamente relacionadas (que difieren sólo en uno o dos nucleótidos) a partir de una sola muestra.

No era probable que las detecciones adicionales de poliovirus por parte del DDNS se debieran a contaminación, dado que tendían a ocurrir en pares de muestras del mismo caso de PFA o en pares de muestras donde el cultivo dio positivo para uno de los pares. Además, DDNS permite una identificación rápida de la contaminación con virus de importancia programática (tipo salvaje y VDPV) debido a la baja probabilidad de secuencias de VP1 idénticas, excepto para aquellas muestras recolectadas del mismo caso o su contacto. Se ha desarrollado un programa de garantía de calidad para DDNS, que incluye el uso de un control positivo de virus liofilizado y banderas de control de calidad integradas en un software hecho a medida que ahora se desarrolla para DDNS (PIRANHA17).

La implementación del método no requiere una instalación de cultivo celular ni la transferencia de muestras a un laboratorio extranjero para la secuenciación Sanger si no hay capacidad local disponible, lo que permite que todos los pasos se realicen en un solo sitio en un único flujo de trabajo optimizado. El costo por muestra es al menos $10 menos para laboratorios de alto rendimiento que pueden maximizar el beneficio de la multiplexación de muestras durante la secuenciación. Esto excluye ahorros adicionales provenientes del envío internacional de muestras y la secuenciación en un centro centralizado. Si bien los salarios del personal y los costos de las instalaciones no se incluyeron en estos cálculos (y variarán mucho entre países), la DDNS de rutina en el INRB se implementó con contribuciones de cinco miembros del personal, en comparación con seis para el método de cultivo celular. Además, apoyó a una fuerza laboral capacitada en técnicas moleculares, incluida la preparación de bibliotecas de secuenciación, la realización de secuenciación y el análisis de datos de secuenciación. Las habilidades y las instalaciones necesarias para la DDNS pueden reasignarse rápidamente a otros patógenos durante emergencias de salud pública. Con la expansión global de la capacidad de secuenciación, existen cada vez más oportunidades para fomentar el desarrollo de estas habilidades y facilitar su contribución a la vigilancia de enfermedades y la genómica de patógenos, potencialmente a través del apoyo bioinformático centralizado de la GPLN, de laboratorios subregionales con experiencia (por ejemplo, INRB ) o de otros organismos regionales (por ejemplo, la Iniciativa de Genómica de Patógenos de los CDC de África).

Una ventaja del DDNS es el potencial de reemplazar completamente el cultivo celular en la mayoría de los laboratorios de polio, lo cual es costoso e indeseable a medida que el poliovirus entra en contención global18. Para que el DDNS se mantenga, se deben superar los desafíos con las cadenas de suministro, ya que los países que probablemente se beneficiarán más de la detección rápida también tendrán más dificultades para suministrar reactivos para la secuenciación de nanoporos. Antes de la implementación también sería necesario un cálculo económico completo de los costos de implementación en toda la GPLN. Para los laboratorios que también analizan muestras de vigilancia ambiental (ES), se puede utilizar DDNS para estas muestras, proporcionando lecturas de secuenciación para múltiples plantillas de virus, como puede ocurrir en las aguas residuales12. Sin embargo, los métodos de detección directa normalmente sólo permiten volúmenes de muestreo relativamente pequeños (cientos de microlitros para una extracción de ARN en comparación con 4 ml para los ocho matraces de cultivo celular que se emplean actualmente); por lo tanto, se requerirá una mayor concentración de muestras de ES y/o extracciones de ARN de gran volumen para permitir lograr un grado similar o mayor de sensibilidad de detección. Actualmente estamos optimizando estos métodos para muestras de ES, que son muy prometedores19.

Durante este estudio de investigación, no se utilizaron secuencias para informar la respuesta al brote porque el método aún no ha sido aceptado ni recomendado por la GPLN15. Ahora estamos trabajando para cumplir con los requisitos de la recomendación GPLN, incluida la implementación piloto de DDNS en laboratorios adicionales en todo el mundo. La GPEI está evaluando un método adicional de detección directa mediante qPCR20 (sin secuenciación), y aún no se ha realizado una comparación entre este método y el DDNS. Se necesitarán más evaluaciones para comparar la precisión de la detección y la velocidad a la que se puede generar una secuencia VP1 mediante los dos métodos, junto con la consideración de la facilidad de implementación y los requisitos de capacitación del personal.

Se recolectaron muestras de heces durante la vigilancia rutinaria de PFA en la República Democrática del Congo entre el 10 de agosto de 2021 y el 4 de febrero de 2022. Estas muestras de diagnóstico se recolectaron como parte del programa rutinario de vigilancia de enfermedades de salud pública y erradicación de la polio del Ministerio de Salud de la República Democrática del Congo y, por lo tanto, se renunció al consentimiento para la recolección de muestras. . Toda la preparación de muestras para secuenciación, análisis genómico y análisis de datos se realizó en muestras anónimas identificables únicamente por su laboratorio o el identificador epidemiológico. Se siguieron todas las normas éticas pertinentes.

En este estudio se procesaron las 2.339 muestras recibidas en el Laboratorio Nacional de Polio (INRB) de casos de PFA, de la comunidad y de contactos. Se recomienda recolectar dos muestras de heces de niños de 0 a 14 años con AFP, dentro de los 14 días posteriores al inicio de la parálisis y con al menos 24 h de diferencia. Además, normalmente se recogen muestras únicas de heces de contactos sanos de niños con PFA de niños menores de 5 años y, en ocasiones, de la comunidad en general.

El sobrenadante de heces tratadas con cloroformo se preparó y procesó como se describe en la ref. 21 como parte de la vigilancia rutinaria de las heces por poliovirus. Brevemente, se inocularon 0,8 ml de sobrenadante de heces tratadas con cloroformo en dos matraces de cultivo que contenían células L20b y dos matraces que contenían células RD. Después de dos pases, se usó 1 μl del sobrenadante de los matraces de cultivo donde las células habían mostrado efectos citotóxicos del poliovirus sospechosos en L20B para la diferenciación de qPCR intertípica utilizando el kit Poliovirus rRT-PCR ITD v5.2 siguiendo el protocolo del fabricante con una investigación adicional de rutina de los VDPV. .

Cuando fue necesaria la secuenciación, el cultivo aislado se secó en tarjetas de Flinders Technology Associates y se envió al NICD en Sudáfrica para la secuenciación de Sanger.

El sobrenadante de heces tratado con cloroformo se sometió a extracción de ARN utilizando QIAamp Viral RNA Mini Kits (n.º 51106, utilizado para muestras procesadas de agosto de 2021 a septiembre de 2021) o Roche High Pure Viral RNA Kits (n.º 11858882001, utilizado para muestras procesadas de octubre de 2021 a febrero de 2022). según los protocolos de los fabricantes utilizando un volumen de 140 µl y 200 µl de sobrenadante, respectivamente. La selección del kit de extracción de ARN se determinó según la disponibilidad del kit, pero ambos kits han sido validados para el método DDNS22. El ARN extraído se almacenó a +4 °C durante la preparación de la PCR anidada si se realizó el mismo día o a -80 °C si se retrasó más de 24 h.

El DDNS basado en una PCR anidada con código de barras y la secuenciación de amplicones en secuenciadores de nanoporos se realizó como se describe en la ref. 12. En resumen, se realizó una PCR anidada utilizando 5 µl de ARN extraído y cebadores pan-Enterovirus23 y el producto se utilizó para una PCR de VP1 específica de poliovirus utilizando cebadores con código de barras12. Se combinaron dos microlitros de cada producto de PCR antes de limpiar con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, #A63880) y la biblioteca de secuenciación se preparó con los kits de secuenciación de ligadura LSK-110 de Oxford Nanopore Technologies. El protocolo completo se puede encontrar en la ref. 24.

Las bibliotecas se secuenciaron en los secuenciadores GridION, MK1c o MinION de Oxford Nanopore Technologies durante entre 4 y 12 h utilizando celdas de flujo R9.4. Las series de secuenciación se realizaron entre el 29 de septiembre de 2021 y el 17 de febrero de 2022. El equipo de estudio que realizó DDNS desconocía los resultados del algoritmo estándar de oro mientras se procesaban las muestras.

La llamada base de secuencia se realizó usando guppy con demultiplexación y mapeo de las lecturas realizadas usando RAMPART25,26 y el módulo de análisis de polio en tiempo real25. Las secuencias de consenso de VP1 se generaron mediante cuatro rondas iterativas de mapeo utilizando el algoritmo mafft27 y puliéndolas con racon28 antes de llamar al consenso con medaka29. El árbol fechado de probabilidad máxima para el brote RDC-MAN-3 se creó en R versión 4.1.3 utilizando el paquete Análisis de filogenética y evolución (ape)30, el paquete Análisis y reconstrucción filogenética (phangorn)31 y el paquete treedater32. Se asumió una velocidad de reloj molecular de 0,01 sustituciones por sitio por año sobre la base de la ref. 33.

El tiempo transcurrido entre el inicio del caso y la secuencia generada mediante DDNS y el algoritmo estándar se comparó mediante una prueba U de Mann-Whitney bilateral. Se calcularon intervalos de confianza binomiales exactos para la sensibilidad y especificidad de los dos métodos y se realizó la comparación mediante una prueba exacta de Fisher bilateral.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las secuencias generadas durante este estudio están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos con el número de acceso PRJEB61181. Los metadatos de muestra se muestran en la figura 2 de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

La versión actual del software analítico para analizar datos DDNS se puede encontrar en https://github.com/polio-nanopore/piranha.

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Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio de Genómica de Patógenos del INRB por su apoyo durante este trabajo, especialmente a P. Paku, R. Lumembe, G. Kabamba, F. Muyembe, R. Ola y C. Musuamba. También agradecemos a los administradores de datos del laboratorio de virología de la polio, T. Changa Changa y J.-C. Changa Changa por su colaboración. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1171890 y OPP1207299). AS, CT, JA y NCG reconocen la financiación del Centro MRC para el Análisis Global de Enfermedades Infecciosas (referencia MR/R015600/1), financiado conjuntamente por el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MRC) y la Oficina de Asuntos Exteriores, Commonwealth y Desarrollo del Reino Unido (FCDO) , bajo el acuerdo Concordato MRC/FCDO y también son parte del programa EDCTP2 apoyado por la Unión Europea; y reconocer la financiación de Community Jameel. NCG está financiado por el Comité de Investigación de la Polio de la OMS. CP y BW agradecen la financiación de la Fundación Bill y Melinda Gates (INV-025345). TKM, ELL, AAA, EKL, JCMC, MA, YL, BN, EP, YR y PM-K. Reconocer el apoyo de la Iniciativa de Genómica de Patógenos de los CDC de África (Africa PGI). AO y AR agradecen el apoyo de Wellcome Trust (Premio a los Colaboradores 206298/Z/17/Z–ARTIC).

Estos autores contribuyeron igualmente: Alexander G. Shaw, Tresor Kabeya Mampuela, Emmanuel Lokilo Lofiko, Catherine Pratt.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Javier Martin, Nicholas C. Grassly, Placide Mbala-Kingebeni.

Centro MRC para el Análisis Global de Enfermedades Infecciosas, Escuela de Salud Pública, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Alexander G. Shaw, Catherine Troman, Joyce Odeke Akello, David Jorgensen y Nicholas C. Grassly

Servicio de Microbiología, Departamento de Biología Médica, Clínicas Universitarias de Kinshasa (CUK), Universidad de Kinshasa (UNIKIN), Kinshasa, República Democrática del Congo

Hay más de 1000 vídeos en todos los formatos de Youtube utilizando el motor de búsqueda Genius.

Instituto Nacional de Investigaciones Biomédicas, Kinshasa, República Democrática del Congo

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Facultad de Salud Pública, Centro Médico de la Universidad de Nebraska, Omaha, NE, EE. UU.

Catherine Pratt y Bailey Blanco

Departamento de Vacunas, Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas (NIBSC), Agencia Reguladora de Medicamentos y Productos Sanitarios, Potters Bar, Reino Unido

Erika Bujaki y Javier Martín

Instituto de Ecología y Evolución, Universidad de Edimburgo, Laboratorios Ashworth, Edimburgo, Reino Unido

Anne O'Toole y Andrew Rambaut

TransVIHMI (Investigación traslacional sobre el VIH y las enfermedades infecciosas endémicas y emergentes), Universidad de Montpellier (UM), Instituto Nacional de Investigación para el Desarrollo Sostenible (IRD), INSERM, Montpellier, Francia

Eddy Kinganda Lusamaki

Fundación Bill y Melinda Gates, Seattle, WA, EE. UU.

Por Kathleen E. Rankin

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

AGS, TKM, ELL, CP, EKL, AO, KER, JM, NCG y PM-K. escribió el periódico. AGS, TKM, CP, CT, EB, JOA, AAA, JCM, MA, YL, BN, BW y EP realizaron el trabajo experimental. AO y AR crearon y desarrollaron el software utilizado para el procesamiento de datos de secuenciación. AGS, ELL, CP, AO, EKL, DJ, JM y NCG realizaron el análisis de datos. YR, KER, AR, SAM, JJM, JM, NCG y PM establecieron el estudio. AGS, TKM, ELL, CP y AAA supervisaron la implementación del estudio. Todos los autores revisaron y aprobaron el artículo final.

Correspondencia a Alexander G. Shaw.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Steve Kroiss, Melinda Suchard y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Tablas complementarias 1 a 3 y figura 1.

Tabla de tiempo requerido para cada paso en cada método.

Descriptores de secuencias DDNS.

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Reimpresiones y permisos

Shaw, AG, Mampuela, TK, Lofiko, EL et al. Detección sensible de poliovirus mediante PCR anidada y secuenciación de nanoporos: un estudio de validación prospectivo. Nat Microbiol 8, 1634-1640 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01453-4

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Recibido: 16 de marzo de 2023

Aceptado: 19 de julio de 2023

Publicado: 17 de agosto de 2023

Fecha de emisión: septiembre de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01453-4

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